Протеогликаны культуры миобластов L6J1: характеристика и влияние на адгезию, пролиферацию и дифференцировку миобластов

• Автор: Ермакова, Ирина Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 106 с. : ил.

Введение

Список сокращений

1. Литературный обзор

1.1. Протеогликаны и фибриллярные белки как основа ВКМ

1.2. Структура и классификация протсогликанов

1.3. Функции протеогликанов

1.4. Участие протеогликанов в регуляции поведения клеток

1.4.1. Участие протеогликанов в регуляции адгезии клеток

1.4.2. Влияние протеогликанов на пролиферацию и дифференцировку клеток

1.5. Роль протеогликанов в миогенезе

1.6. Методы выделения протеогликанов из биологического материала

1.6.1. Экстракция
1.6.2. Осаждение из раствора
1.6.3. Центрифугирование в градиенте плотности
1.6.4. Хроматография
1.7. Количественный и качественный анализ протеогликанов .
1.7.1. Обнаружение с помощью красителей и цветных реакций
1.7.2. Обработка специфическими ферментами
1.8. Массспектрометрическая идентификация протеогликанов
2. Материалы и методы исследования
2.1. Реактивы и материалы
2.2. Методы
2.2.1. Миобласты Ь6Л и их культивирование
2.2.2. Выделение протеогликанов
2.2.3. Анализ углеводного состава протеогликанов
2.2.4. Электрофоретический анализ коровых белков протеогликанов
2.2.5. Массспектрометрический анализ протеогликанов
2.2.6. Изучение действия протеогликанов на адгезию миобластов
2.2.7. Изучение влияния гликозамипогликанов в комбинации с фактором роста фибробластов на пролиферацию миобластов
2.2.8. Изучение влияния гликозаминогликанов и протеогликана декорина на дифференцировку миобластов
3. Результаты
3.1. Выделение протеогликанов из культуральной среды, клеток и
3.1.1. Анализ эффективности процедуры разделения протеогликанов культуральной среды, клеток и ВКМ
3.1.2. Ионообменная хроматография протеогликанов на сефарозе
3.2. Анализ углеводного состава протеогликанов
3.3. Электрофоретический анализ протеогликанов
3.3.1. Электрофоретический анализ фракций протеогликанов миобластов, ВКМ и культуральной среды, полученных
после разделения на сефарозе
3.3.2. Оценка эффективности выявления коровых белков протеогликанов на примере декорина
3.3.3. Выявление коровых белков выделенных протеогликанов
3.4. Массспектрометрическая идентификация протеогликанов
3.5. Действие протеогликанов на адгезию миобластов
3.6. Влияние основного фактора роста фибробластов в комбинации с
гликозаминогликанами хондроитинсульфатом,
дерматансульфатом, гепарином на пролиферацию миобластов
3.7. Влияние гликозаминогликанов хондроитинсульфата,
дсрматансульфата, гепарина и протеогликана декорина на
дифференцировку миобластов
4. Обсуждение результатов
5. Выводы
6. Список работ, опубликованных по теме диссертации
7. Список цитируемой литературы
Введение


ПГ в регуляции процессов миогенеза, конкретные функции ПГ и механизмы их участия в этих событиях остаются в большой степени на уровне предположений. ПГ, синтезируемых миобластами 6. I1, и исследовании их влияния на адгезию, пролиферацию и дифференцировку этих клеток. ПГГАГ на дифференцировку миобластов. Работа выполнена при финансовой поддержке СПб НЦ РАН проекты 2, 2 и 2. ВКМ заполняет пространство между клетками в тканях и состоит из фибриллярных белков и аморфного вещества ГАГ и ПГ , i, . Белки ВКМ условно делят на структурные коллаген, эластин и адгезивные фибронектин, ламинин и др Большая часть белков ВКМ гликозилирована и содержит от 5 до углеводов . ВКМ это ПГ, молекулы которых могут содержать до сахаров I, . Состав ВКМ варьирует для различных тканей Ii, , , v, , что в значительной степени зависит от соотношения белков и Г. Это соотношение определяет физические свойства ВКМ , . Например, в хрящевой ткани преобладают ПГ, которые составляют около сухого веса ткани , i, . Именно ПГ благодаря своей объемной сильно гидратированной структуре ответственны за функциональные свойства этой ткани, обеспечивая ее тургор, т. В то же время доля ПГ не превышает 1 сухого веса сухожилий I, , и основной компонент ВКМ этой ткани коллаген I типа, образующий прочные надмолекулярные структуры, отвечающие за способность этой ткани выдерживать растяжение , . Свойства ВКМ не ограничиваются только созданием прочной структурной основы для ткани. ВКМ также оказывает существенное влияние на поведение клеток, включая рост и выживание клеток, их пролиферацию, миграцию и дифференцировку , . Связывание элементов ВКМ, как белков, так и ПГ, с клеточными рецепторами может привести к запуску различных сигнальных каскадов, регулирующих с одной стороны пролиферацию и выживание клеток, а с другой стороны вызывающих их гибель. По этому признаку компоненты ВКМ делят на про и антиапоптотнческие I, i . Устойчивость клеток к аноптозу обеспечивают фибронектин, действующий через сигнальные пути , , I3, и ламинин , активирующий протеинкиназу . Апоптотичсское влияние оказывают такие компоненты ВКМ, как тромбоспондин1, действующий посредством связывания со скавенджеррсцсптором , и ПГ декорин, вызывающий активацию каспазы3 по неизвестному механизму i . Как ПГ, так и белки ВКМ например, коллагены способны связывать и удерживать в ВКМ факторы роста, однако свойство модулировать активность факторов роста и тем самым регулировать различные клеточные процессы приписывают именно ПГ i, i, , , . История изучения ПГ началась более 0 лет назад Яоэетап, . Однако долгое время химическая структура ПГ оставалась не разгаданной. Эти соединения называли муцинами и предполагали, что они содержат только сахара. В начале прошлого столетия Левене определил, что составными компонентами одного из муцинов хондроитинсульфата, выделенного из хряща, являются Эглюкуроновая кислота, Эгалактозамин, уксусная и серная кислоты в равных соотношениях. Правильная химическая структура для соединений этого семейства была определена позже группой исследователей под руководством Мейера ЯоБетап, . Стало ясно, что исследуемые соединения полисахариды, состоящие из чередующихся сульфатированных молекул уроновых кислот и гликозаминов. В связи со своей структурой они получили название гликозаминогликаны ГАГ устаревшее название мукополисахариды. Полную расшифровку строения ГАГ затрудняли примеси белков, от которых исследователи никак не могли избавиться при получении ГАГ в чистом виде, и которые рассматривали как контаминируюшие соединения. И только в х гг. Шуберта было обнаружено, что ГАГ на самом деле ковалентно связаны с белками. Этот факт привел к открытию нового класса соединений ПГ. ПГ представляют собой соединения, состоящие из молекулы корового белка, ковалентно связанного с одной или более цепями Г АГ. В свою очередь ГАГ это длинные неразветвленные полисахариды, состоящие из повторяющихся дисахаридных звеньев. Один из двух остатков в таком дисахариде всегда аминосахар Ыацетилглюкозамин или Ыацетилгалактозамин, а второй моносахарид уроновая глюкуроновая или идуроновая кислота рис. Рис. Элемент структуры гликозаминогликана дерматансульфат.