Исследование судьбы экзогенной ДНК, интегрированной в геном соматических клеток млекопитающих

• Автор: Иванов, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 145 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение.

Глава I. Обзор литературы

1.1 Интеграция чужеродной ДНК в геном клеток млекопитающих

1.2 Вопрос од экстрахромосомном существовании пДНК у млекопитающих

1.3 Нестабильность интеграции чужеродной ДНК

1.3.1 Нестабильность интеграции вирусной ДНК

1.3.2 Нестабильность интеграции плазмидной ДНК.

1.3.3. Влияние копийности на интеграцию ДНК.

1.3.4 Влияние метилирования на интеграцию ДНК.

1.3.5. Проявление генетической нестабильности интегрированных
ДНК на модели трансгенных мышей
1.4. Наиболее вероятный механизм нестабильности чужеродной ДНК рекомбинация
1.4.1. Гомологичная рекомбинация
1.4.2. Гомологичная рекомбинация и таргетинг генов
1.4.3. Различные проявления негомологичной рекомбинации.
1.5. Молекулярные механизмы рекомбинационных явлений.
1.5.1. Строение и биохимические свойства белка Ясс А
1.5.2. Распространение семейства Кес Аподобных белков
1.5.3. Гомологи белка КесА у эукариот и их функции
1.5.4. Другие белки, взаимодействующие с ВесАЯас1, и необходимые
для рекомбинации.
7.5.5. Белки и КРА
1.5.6. Белок Яаб
1.5.7. Белки ВЯСА ВЯСА2.
1.5. Б. Другие белки, способствующие рекомбинации.
1.5.9. Оверэкспрессия рекомбинантных белков в клетках млекопитающих.
1.5 Белки, осуществляющие негомологичное воссоединение
концов ДНК.
1.5 Изменения в структуре хроматина, происходящие во время негомологичного воссоединения концов ДНК.
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Культуры клеток
2.2. Плазмиды, использованные в работе.
2.3. Электропорация получение и селекция клеток линии А.
2.4. Анализ наличия трансгенной ДНК в клетках.
2.4.1. Выделение ДНК.
2.4.2. Подготовка геномной ДНК для использования в качестве вектора для трансфекции
2.4.3. Анализ методом ПЦР
2.4.4. Секвенирование ДНК.
2.5. Анализ экспрессии гена тимидинкиназы вируса герпеса.
2.6. Получение и анализ клонов клеток млекопитающих,
экспрессирующих белок .
2.6.1. Вестерн блот
2.6.2. .
2.7. Статистическая обработка результатов.
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Изучение феномена нестабильности.
3.2. Доказательства действительности потери чужеродной ДНК из
генома культивируемых клеток линии А
3.3. Проявление нестабильности интеграции чужеродной ДНК
различных плазмидных конструкций на разных клеточных линиях
3.4. Поиск и исследование факторов, влияющих на нестабильность
3.4.1. Облучение урадиацией.
3.4.2. Влияние усиления гомологичной рекомбинации за счет экспрессии бактериального белка .
3.4.2.1. Получение клеточных линий, экспрессирующих
3.4.2.2. Проверка наличия гена в трансфецированных клетках и его экспрессии
3.4.2.3. Проверка работоспособности белка в эукариотических клетках юблучение и
3.4.2.4. Нестабильность чужеродной пДНК в клетках, экспрессирующих .
3.4.3. Конструирование плазмиды, содержащей последовательности флангов интеграции, и ее анализ.
3.4.3.1. Стратегия получения плазмиды, содержащей
фланги места интеграции в геном плазмиды р
3.4.3.2. Выбрасывание из генома клеток линии А
ДНК вторичной плазмидыр
3.4.3.3. Определение нуклеотидной последовательности флангов места интеграции в геном первоначальной плазмиды
Глава 4. Обсуждение.
Список цитируемой литературы.
Принятые сокращения.
6 6тиогуанин
АТФ Аденозинтрифосфат
БДУ Бромдезоксиуридин
ВПГ1 Вирус простого герпеса
ГР Гомологичная рекомбинация
ДАБ 3,3диаминобензидин
днДПК двунитевая ДНК
ДР двунитевые разрывы ДНК
ДТА цепь дифтерийного токсина
КРС сыворотка крови крупного рогатого скота
НВК Негомологичное воссоединение концов ДНК
онДНК однонитевая ДНК
пДНК плазмидная ДНК
п.н. пары нуклеотидов
ПЦР Полимеразная цепная реакция
ТК Тимидинкиназа
ТМ Трансгенные мыши
ЭС эмбриональные стволовые клетки
СНО линия клеток яичника китайского хомячка i
I 4,6iii2Ii
i ориджии репликации
Белок репликации ii i
Белок, связывающий онДНК i ii i
V обезьяний вирус ii vi
большой антиген вируса V
бактериальный белок , модифицированный сигналом ядерной локализации большого Гантигена вируса V
Введение
Актуальность


Хотя предположения о существовании подобных систем у эукариот существуют достаточно давно, а их работе у растений посвящен целый выпуск журнала , , . Данное исследование говорит о необходимости дополнительного изучения систем поддержания стабильности генома и репарации у млекопитающих. Это приобретает особую актуальность в случаях удаления из генома интегрированной ДНК провирусов, а также в случаях генной терапии различных заболеваний. Хотя данное исследование проведено на культурах клеток, явление нестабильности введенной ДНК проявляется и на трансгенных животных , , vv, i, , что также необходимо учитывать при проведении соответствующих экспериментов. Кроме того, настоящая работа нарушает классическую концепцию, согласно которой трансген после интеграции в геном рассматривается как часть хозяйской хромосомной ДНК, неотличимой от собственных генов организма. Разработана стратегия оценки степени нестабильности в динамике во время культивирования клеток млекопитающих i vi. На модели культуры клеток А и плазмиды р наблюдается явление направленного удаления чужеродной ДНК, предварительно интегрированной в геном. Попытки усилить ГР в клетках исследуемых линий с помощью экспрессии бактериального белка не приводят к существенным изменениям нестабильности интегрированных чужеродных генов. С помощью оригинального подхода по определению влияния нуклеотидной последовательности флангов геномной ДНК, окружающих места интеграции плазмиды, на стабильность существования чужеродной плазмидной ДНК в геноме соматических клеток млекопитающих демонстрируется возможность зависимости судьбы чужеродной ДНК от места ее интеграции в геном. Глава 1. Обзор литературы. Интеграция чужеродной ДНК в геном клеток млекопитающих. Одновременно с изобретением различных эффективных способов переноса чужеродной ДНК в клетки млекопитающих кальцийфосфатный , , , липофекция i . ДНК в геном. В отличие от прокариотических организмов клетки млекопитающих обладают сложно устроенным геномом и огромным ферментативным аппаратом, что значительно усложняет такие исследования. Многие аспекты существования чужеродной ДНК в клетках высших эукариот остаются недостаточно изученными. В нескольких работах исследователи пытались проследить судьбу экзогенной ДНК после проникновения ее в качестве генетического вектора в клетку высших эукариот. После введения методом электропорации в соматические клетки млекопитающих большая часть экзогенной ДНК деградирует под воздействием клеточных экзо и эндонуклеаз , i, . Если векторная ДНК плазмида имеет кольцевое строение, то перед дальнейшими событиями она переводится в линейную форму. По всей видимости, рестрикция такой плазмиды происходит достаточно случайно по всей длине ДНК. В дальнейшем происходит эффективное лигирование концов линейной молекулы ДНК , . Кроме того, оба конца такой экзогеной линейной ДНК подвергаются атаке и экзонуклеаз . Возможны различные стратегии обработки концов ДНК iv, i, . С одной стороны, и экзонуклеазы действуют совместно, при этом протяженность разрушенных участков ДНК может оказаться достаточно значительной. ДНК i, . С другой стороны, с концами потенциально интегрирующих фрагментов ДНК связываются ферменты, обладающие только одной 5 3 экзонуклеазной активностью. По такому сценарию работает продукт гена I клеток китайского хомячка линии СНО и дрожжей vii . Этот белок катализирует образование двойных разрывов ДНК, инициируя начало мейоза. После возникновения таких разрывов белок остается связанным с образовавшимися 5 концами ДНК, позволяя 5 3 экзонуклеазам процессировать 5 концы , . Было установлено, что белок гомологичен новому семейству топоизомераз типа 2, впервые открытому у архебактерий топоизомераза 6 . Многочисленные данные а. ДНК, выполняют роль инициаторов мейотической рекомбинации практически у всех эукариотических организмов. Также у дрожжей . НО, кодируемая геном , которая инициирует сайтспецифичные двойные разрывы и разрушает 5 конец . На 3 конце образуются протяженные участки онДНК, что стимулирует гомологичную рекомбинацию.