Изучение экспрессии генов при дифференцировке и созревании дендритных клеток человека

• Автор: Лаптева, Наталья Эдуардовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 159 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР.ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Определение, классификация и функции дендритных клеток

1.1.1. Типы дендритных клеток

1.1.2. Фенотип.IX

1.1.2.1. Морфология

1.1.2.2 Поверхностные антигены.

1.1.3. Функции дендритных клеток.

1.1.3.1. Иммунный ответ

1.1.3.2. Толерантность к собственным антигенам.

1.2. Дендритные клетки в клинической иммунологии2

1.3. Дендритные клетки и лимфоциты.
1.4. Созревание дендритных клеток.
1.5. Методы изучения дендритных клеток
1.5.1. История.
1.5.2. Получение дендритных клеток i vi
1.5.3. Методы изучения экспрессии генов в дендритных клетках.
1.5.3.1. Секвенирование библиотек кДНК
1.5.3.2. метод
1.5.3.3. Дифференциальный дисплей мРНК.
1.5.3.4. Гибридизация на кДПК матрицу
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Получение дендритных клеток i vi.
2.2. Фенотипирование дендритных клеток моноклональными антителами
2.3. Выделение суммарной РНК и обработка ДНКазой 1
2.4. Обратная транскрипция и амплификация мишеней для макроматриц
2.5. Мечение кДНК мишеней для анализа па макроматрице.
2.6. Гибридизация, детекция и количественный анализ макроматрнц.
2.7. Мечение кДНК мишеней для микроматриц.
2.8. Гибридизация на микроматрицу и количественный анализ.
2.9. Полуколичествениая полимеразная цепная реакция на матрице кДНК
2 Прямое секвенироваиие нуклеотидных последовательностей фрагментов кДНК и поиск гомологии.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Получение i vi незрелых и зрелых дендритных клеток человека. Фенотипирование поверхностных маркеров.
3.2. Мониторинг экспрессии генов в моноцитах и незрелых дендритных клетках методом гибридизации на макроматрице.
3.3. Подтверждение профилей гибридизации на кДНК макроматрицу методом полуколичесвенной ПЦР на матрице кДНК.
3.4. Мониторинг экспрессии генов в незрелых и зрелых дендритных клетках методом гибридизации на микроматрицу.
3.5. Подтверждение профилей гибридизации на кДНК микроматрице методом полу количественной I I на матрице кДНК.
3.6. Экспрессия генов ренинангиотензиновон системы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ДНК или Е8 I 8, серийный анализ экспрессии генов 9, а также гибридизация на кДНК микроматрицу . Целью настоящей работы было выявление генов, экспрессирующихся при лифференцировке незрелых ДК из моноцитов периферической крови человека И при созревании дендритных клеток. Выявление ранее неописанных молекулярнобиологических процессов, участвующих в реализации функций ДК. Для изучения изменений экспрессии генов при лифференцировке и созревании ДК из моноцитов использовался подход гибридизации на кДИК макро и микроматрицы с последующим подтверждением интенсивностей ибридизационных сигналов методом полуколичественной полимеразной цепной реакции ПЦР. Гены, фрагменты которых нанесены на коммерческие макроматрицы 8 генов и микроматрицы ген, кодируют широкий спектр белков, играющих ключевую роль во многих биологических процессах. При сравнении профилей гибридизации на кДНК макроматрицу из моноцитов и иДК двух доноров были выявлены дифференциально экспрессирующиеся гены, белковые продукты которых вовлечены в дифференцировку. ДК. Для идентификации изменений в экспрессии генов, происходящих при созревании нДК в зДК. Повышенная экспрессия генов, кодирующих различные факторы роста и иммунологическиактивные молекулы, была впервые показана в ДК и зДК. Методом полу количествен ной НДР на матрице кДНК в образцах четырех здоровых доноров была подтверждена повышенная экспрессия в нДК по сравнению с моноцитами следующих генов альфакатенина, ФНОа , рецептора ФИО II. РМ1 и интегрина альфа 6 также была подтверждена методом полуколичественной ПЦР в зДК по сравнению с нДК. Экспрессия в ДК гена реиинсвязывающего белка была впервые детектирована нами и ранее не показана и клетках крови. Мы применили метод полуколичественной ПЦР на матрице кДНК для анализа экспрессии генов ренина, ангиотепчиногена предшественник ангиотензина, рецептора ангиотензина II вазопрессина, рецепторов ангиотензина 1 и 2 и ангиотензиниревращающего фермента в моноцитах. ДК и зДК. Во всех исследованных клепках четырех доноров была обнаружена экспрессия мРПК ренинсвязывающего белка, ангиотензиногеиа, ангиотензинпревращающего фермента п рецептора ангиотензина II вазопрессина. В работе обсуждается возможная функция ренинаигиотензиновой системы в реализации функций ДК при иммунном ответе и воспалении. Таким образом, в работе проведен скрининг экспрессии сотен генов при днфференцировке и созревании ДК. ДНК макро и микроматрицы. Полученные данные расширяют знания о дифферениировке, созревании и функциях ДК и, возможно, будут полезными в изучении заболеваний, в которые вовлечены ДК. Результаты работы отражают картину изменения экспрессии генов на транскрипционном уровне и открывают новые перспективы для дальнейших функциональных исследований дендритных клеток. ГЛАВА 1. Определение, классификация и функции дендритных клеток. Дендритные клетки ДК рисунок I являются анти ге представ л я ю щим и клетками с уникальной способностью обеспечивать первичный иммунный ответ 4. II. ДК захватывают антиген и переносят информацию о нем к клеткам адаптивной иммунной системы. Уникальная функция ДК состоит в их способности активировать иммунный ответ посредством влияния на наивные Тклетки С4С18 Тлимфоциты, которые никогда не встречались с антигеном . ДК играют важную роль не только в индукции первичного иммунного ответа, но в индукции иммунологической толерантности, а также в регуляции вторичного антигенспецифического опосредованного Тклетками иммунного ответа . В и Тлимфоцитов находится под контролем дендритных клеток 1. На сегодняшний день в гематологии не существует четкого определения ДК. Их название происходит от их морфологии наличие древовидных отростков , и охватывает несколько гетерогенных популяций с различными функциями, зависящими от степени зрелости ДК. Повышенная экспрессия ГКГС класса . Активная способность мигрировать из тканей и двигаться по лимфе в Гзон. Рисунок 1. Незрелые АС и зрелые 1Р дендритные клетки периферической крови человека Ьи а1, .