Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца

• Автор: Озерова, Светлана Геннадиевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с.

Введение.

Глава I. Обзор литературы

1. Активация яйца

1.1. Возможные способы активации яйца рыб.

1.2. Спонтанная активация яйца рыб.

1.3. Искусственная активация яйца рыб.

1.4. Активация яйца при гиногенезе у рыб

2. Сохранение яйцом способнос ти к оплодотворению в разных условиях.

2.1. Происхождение полостной жидкости у рыб.

2.2. Состав полостной жидкости у рыб

2.3. Функции полостной жидкости у рыб.

2.4. Изучение влияния ингибиторов протеаз на процесс активации и шодотворения.
3. Особенности организации кортикального слоя зрелого яйца рыб. .
3.1. Строение неоплодотворенного яйца медаки
3.2. Строение неоплодотворенного яйца данио.
3.3. Кортикатьные гранулы рыб.
3.3.1. Строение и состав кортикальных гранул рыб.
3.3.2. Образование кортикальных гранул в ооцитах рыб.
4. Общие закономерности экзоцитоза кортикальных гранул в яйце
4.1. Экзоцитоз кортикальных гранул у осетровых рыб.
4.2. Особенности экзоцитоза кортикальных ранул у костистых
5. Роль экзоцитоза кортикальных гранул в блокировании полиспермии
5.1. Полиспермия как следствие замедления и подавления экзоцитоза кортикальных гранул
6. Роль подмембранного цитоскелета яйца в экзоцитозе кортикальных гранул.
7. Участие ионов кальция в процессе активации яйца.
7.1. Источники ионов кальция и механизмы его высвобождения. .
7.2. Са2 зависимые сигнальные процессы активации
7.3. Особенности распространения волны кальция на примере костистых рыб медаки i i и данио i
7.3.1. Изменение концентрации свободных ионов кальция в яйце медаки.
7.3.2. Изменение концентрации свободных ионов кальция в яйце данио
8. Участие ионов кальция в регуляции экзоцитоза кортикальных гранул.
8.1. Влияние ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул у рыб
9. Влияние форболовых эфиров на экзоцитоз кортикальных гранул
. Кальцийсвязывающие белки.
.1. белки.
.1.1. Кальмодулин.
.1.2. 0 белки
.2. Аннексины.
.3. С2 кальцийсвязывающие белки.
Глава II. Материалы и хметоды
1. Объекты исследований. Способы получения половых продуктов
2. Выделение и очистка смеси аннексинов из зрелых яиц вьюна
3. Выделение и очистка аннексинов из зрелых яиц данио
4. Массспектрометрический анализ белков, выделенных из ооцитов данио.
5. Иммунизация лаборагорьх животных
6. Выделение и очистка поликлональных антител к белку ЗкДа.
7. Иммунологический анализ материала яиц вьюна и данио
8. Иммунологический анализ образцов различных тканей вьюна
9. Получение 3 концевой нуклеотидной последовательности аннексина кДа
. Определение размеров мРНК аннексина кДа данио
. Получение 5концевой нуклеотидной последовательности аннексина кДа данио
. Получение 5концевых последовательностей кДНК аннексииов А.1, А.2 и АЗ данио.
. Получение полноразмерных к ДНК аинексинов А.1 и А.2.
. Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина
. Микроинъекции
. Световая и электронная микроскопия.
. Определение количест ва актина в яйце вьюна.
Глава Ш. Результаты.
1. Влияние ионов кальция и фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцах вьюна.
1.1. Строение кортикального слоя яйца вьюна и экзоцитоз кортикальных гранул.
1.2. Влияние ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцах выона.
1.3. Влияние фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул
2. Влияние сред различного состава на спонтанную активацию яйца вьюна и данио.
2.1. Изучение влияния сред разного состава на процесс спонтанной
активации икры выона и данио
2.2. Влияние лейпептина и апротинипа ингибиторов протеаз на спонтанную активацию яиц выона и данио и на их последующую способность к оплодотворению
2.3. Влияние форболовых эфиров на активацию яиц вьюна и

3. Идентификация калъцийсвязывающих белков, присутствующих в ооцитах данио и яйцеклетках выона
3.1. Выделение белков группы аннсксинов из яиц рыб
3.2. Получение моноспецифических поликлональных антител к
белку кДа выона
3.3 Исследование распределения белка кДа в разных тканях выона.
3.4. Получение и анализ кДНК, содержащей полноразмерную кодирующую последовательность белка с молекулярной массой кДа данио.
3.5. Идентификация аннексинов, выделенных из ооцитов данио .
3.6. Идентификация в ооцитах данио копина III
3.7. мРНК аннексинов, запасенные в ооцитах данио
3.8. Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина А.
Обсуждение
Заключение
Список сокращений.
Благодарности.
Список литературы


Материальь диссертации докладывались на коллоквиумах лаборатории экспериментальной эмбриологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН на конференции Молекулярные механизмы процессов онтогенеза Москва, г. Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи, все в рецензируемых журналах и тезисы двух докладов. Работа проводилась в лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д.П. Филатова Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Научное руководство осуществлял к. А. А. Минин. Глава I. Функция яйцеклетки своеобразна и заключается в том, чтобы дать начало новому организму. Яйцеклетка специально организована для выполнения этой задачи и обладает особым строением ядра, цитоплазмы и оболочек. К концу оогенеза процессы мейоза в ней затормаживаются на определенной различной у разных животных стадии развития. Теперь яйцеклетка готова реализовать заложенную программу развития. Однако для этого она должна активироваться. В широком смысле под активацией яйцеклетки понимают, ранний этап развития, включающий переход зрелого яйца из состояния покоя к развитшо, который происходит при оплодотворении или партеногенезе Гинзбург, Зуссман, Карлсон, . Активация процесс сложный и многоступенчатый, состоящий из серии взаимосвязанных событий, происходящих в яйце от момента контакта со спермием или приложения иного активирующего воздействия до начала дробления. Хорнер и Вольфнер , , в своем обзоре рассматривают активацию как комплекс взаимосвязанных событий, сопровождающих переход от зрелого ооцита к развивающемуся зародышу. Авторы выделяют следующие основные этапы активации преобразование оболочки яйца, которое делает ее непроницаемой для многочисленных спермиев и тем самым обеспечивает блокирование полиспермии, завершение мейоза в тех случаях, когда он не был завершен, формирование женского и мужского пронуклеусов, изменение состава мРНК и белков, запасенных в яйце, реорганизация цитоскелета. Отмечается также, что в процессе активации в яйце повышается обмен веществ и активируется синтез белка. Активация зрелой яйцеклетки у позвоночных животных в норме обычно запускается спермием . Рыбы являются самым многочисленным классом позвоночных, отличающимся большим разнообразием в строении гамет и условий их соединения, поэтому способы активации у них по сравнению с другими животными более разнообразны. Размножение и развитие рыб имеет ряд специфических особенностей, обусловленных водным образом жизни. У большинства рыб осеменение наружное, при этом половые клетки выводятся в воду, где происходит оплодотворение и дальнейшее развитие зародыша. Зрелое яйцо рыб может активироваться спермием в процессе оплодотворения. Этот способ активации показан у таких рыб, как медака i i, кета , восточная сельдь i I, и нильская тиляпия i ii , , . При таком способе активации оплодотворяющий спермий выполняет две функции генетическую и активационную. Известно, что у многих рыб при попадании в воду яйцо спонтанно активируется. В ряде работ последних лет, проведенных на данио, этот процесс был изучен более подробно. ЗО секунд после контакта с водой , , , , . В отсутствии спермия, в спонтанно активированном яйце происходят некоторые процессы, характерные для раннего развития, в частности подъем концентрации ионов кальция и экзоцитоз кортикальных гранул, однако очень быстро наступает гибель активированного гаплоидного яйца. Если оплодотворение произошло, и диплоидность восстановилась, развитие зародыша происходит нормально. По мнению авторов исследования, при естественном нересте данио сначала происходит активация яйца, далее за время менее с, а скорее всего за 5 с, следует оплодотворение спермием . В данном случае, активирующим агентом является среда оплодотворения, роль спермия же ограничивается доставкой генетического материала. Стратегия активацияоплодотворение, описанная выше для данио, по,видимому, не является уникальной. Яйца рыб могут активироваться без участия спермия, в результате действия различных активирующих агентов.