Исследование механизма адаптации злокачественных опухолей к гипоксии: роль мембранных фосфолипидов и фосфоинозитид-зависимых киназ

• Автор: Павличенко, Оксана Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.25, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гипоксический синдром i viv и i vi.

1.1.1. Классификация гипоксических состояний

1.1.2. Тканевая гипоксия.

1.1.3. Клеточная гипоксия

1.1.4. Компенсаторноприспособительные реакции при гипоксии

1.2. Регуляция клеточного метаболизма в условиях гипоксии.

1.2.1. Регулятор кислородного гомеостаза.

1.2.2. Кислородзависимая регуляция НИМ

1.2.3. Кислороднезависимая регуляция I

1.2.4. Экспрессия I1 в злокачественных опухолях человека
1.3. V и его роль в выживаемости клеток в условиях гипоксии
1.3.1. Участие V в регуляции ангиогенеза
1.3.2. Факторы роста клеток эндотелия сосудов
1.3.3. Фактор роста эндотелия сосудов V.
1.3.4. Изоформы фактора роста V.
1.3.5. Рецепторы, взаимодействующие с фактором роста V V1 и V2.
1.3.6. Сигнальные пути, в которых участвуют рецепторы семейства V.
а Сигнальные пути с участием рецептора V1.
б Сигнальные пути с участием рецептора V2.
1.4. Современные представления о механизме адаптации опухолевых клеток к гипоксии
1.4.1. Регуляция выживаемости опухолевых клеток в условиях гипоксии i viv и i vi. Сигнальные пути, активируемые в опухолевых клетках в условиях гипоксии и их значение в адаптации клеток к гипоксии
1.4.2. Роль стероидных гормонов в регуляции активности гипоксиязависимых сигнальных путей
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Культивирование клеток
2.2. Окраска клеток на морфологию гематоксилинэозином.
2.3. Определение скорости роста клеток.
2.4. Приготовление клеточных экстрактов и электрофорез в
полиакриламидном геле
2.5. Иммуноблоттинг вестернблоттинг.
2.6. Транзиторная трансфекция и определение активности гена
репортера
2.7. Иммуноцитохимическое определение экспрессии 1 в клеточных линиях опухолей.
2.8. Выделение РНК из культивируемых клеток
2.9. Определение экспрессии гена V2 и V методом
обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции .
Список использованных растворов.
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Влияние гипоксии на динамику роста культивируемых i vi клеток аденокарциномы яичника v
3.1.1. Влияние индуктора гипоксии СоСЬ на динамику роста клеток v
3.1.2. Влияние индуктора гипоксии СоСЬ на уровень внутриклеточного V в клетках v.
3.2. Развитие адаптации клеток v к гипоксии в условиях длительного воздействия на клетки гипоксических факторов.
Морфофункциональные изменения клеток в процессе адаптации к гипоксии
3.2.1. Развитие резистентности к гипоксии i vi
3.2.2. Морфофункциональные изменения клеток в процессе адаптации к гипоксии
3.3. Анализ экспрессии фосфатидилинозитол3киназы I3 и РКзависимых белков 3 при адаптации клеток v к гипоксии
3.3.1. Влияние гипоксии на синтез I3 и
3.4. Влияние трансфекции в клетки I3 и ЭТАТЭсодержащих плазмид на чувствительность клеток к гипоксии. Развитие резистентности клеток v к гипоксии в условиях постоянной активации I3 и 3 под действием дексамстазона
3.4.1. Трансфекция каталитической субъединицы I3 приводит к увеличению синтеза V и развитию резистентности клеток к гипоксии
3.4.2. Трансфекция в клетки v БТАТЗсодержащей плазмиды приводит к развитию резистентности клеток к гипоксии
3.4.3. Влияние дексаметазона на рост клеток v. Получение гормонрезистентной сублинии клеток
3.4.4. Влияние дексаметазона на синтез I3 в клетках v. Конститутивное повышение уровня I3 и 3 в гормонрезистентной сублинии клеток.
3.4.5. Повышенная устойчивость гормонрезистентной сублинии клеток v к гипоксии. Уровень V в гормончувствительной и резистентной линиях клеток
3.5. Эффект перекрестной резистентности клеток, устойчивых к гипоксии, к действию гормональных цитостатиков. Значение координированной активации I3 и 3 в развитии
перекрестной резистентности клеток СаОу к гипоксии и декса метазону
3.5.1. Роль гипоксии в развитии гормональной резистентности опухолевых клеток.
3.5.2. Значение координированной активации РБК и БТАТЗ в развитии перекрестной резистентности клеток СаОу к гипоксии и дексаметазону. Роль РБК в регуляции БТАТЗ
3.6. Чувствительность клеток СаОу, СаОу1 и СаОуН к действию апоптотических агентов
3.6.1. Чувствительность родительских и резистентных клеток СаОу к УФ облучению и адриамицину.
3.6.2. Уровень РКВ, руЛП и рКф1 в клетках СаОу, СаОуБ и СаОуН.
3.7. Роль УЕСЕА в аутокринной регуляции роста и выживаемости клеток СаОу в условиях гипоксии.
3.7.1. Продукция УЕвРА и уровень УЕСР2 в клетках СаОу
3.7.2. Роль УЕвРА в регуляции пролиферации клеток СаОу.
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Но во многом схема сигнальных путей инициируемых I3 и РКВ, до конца не исследована, как остается неясной и роль I3зависимого сигнального пути в регуляции выживаемости клеток в условиях гипоксии. Мы предполагаем, что в условиях длительного воздействия гипоксии на опухолевые клетки и цитотоксических соединений, а именно в процессе медикаментозной терапии, постоянная активация I3 и I3зависимых транскрипционных факторов может приводить к существенной перестройке внутриклеточной сигнальной сети. В свою очередь это может приводить к конститутивной активации РКсигнального пути и увеличению выживаемости клеток при действии как токсических, так и гипоксических факторов. Целью работы является исследование механизма адаптации клеток злокачественных опухолей к гипоксии и изучение внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих выживаемость опухолевых клеток при действии гипоксических факторов. Исследовать влияние гипоксии на динамику роста культивируемых i vi клеток карциномы яичника линии v и уровень экспрессии V. Исследовать возможный механизм адаптации клеток к гипоксии в условиях длительного воздействия на клетки гипоксических факторов изучить изменение морфофункционалыюго состояния клеток в процессе их адаптации к гипоксии. Провести сравнительный анализ чувствительности родительских клеток и клеток, резистентных к гипоксии, к действию цитостатических и апоптотических соединений. Исследовать уровень VА и рецептора V в . Изучить значение Vсигнального пути в аутокринной регуляции роста и выживаемости клеток v. Научная новизна работы. Известно, что к ранним проявлениям реакции злокачественных опухолей на гипоксию относится активация гипоксияиндуцируемого фактора 1, регулирующего экспрессию фактора роста эндотелия сосудов и некоторых других генов, ответственных за выживание опухоли в условиях гипоксии. Установлено, что в активации I1 и V могут принимать участие I3 и ферменты РКзависимого сигнального пути, в частности протеинкиназа В, однако их значение в регуляции ответа опухолей на гипоксию остается неясным. В настоящей работе впервые исследовалась роль ферментов фосфатидилинозитольного сигнального пути I3, РКВ, 3 в регуляции ответа клеток на гипоксию и их значение в развитии резистентности опухолевых клеток к гипоксии. В предварительных исследованиях на модели клеток карциномы яичника, отличающихся по чувствительности к гипоксии, нами было продемонстрировано, что активация РКзависимого сигнального пути может являться одним из факторов, обеспечивающих адаптацию опухолевых клеток к гипоксии i vi. Исследования носят экспериментальный характер и направлены на изучение природы биохимических путей, поддерживающих рост злокачественных опухолей в условиях гипоксии. Представленные данные демонстрируют возможность адаптации культивируемых i vi опухолевых клеток к гипоксии, развивающейся на фоне координированной активации I3 и 3, и повышенной продукции клетками V. При этом адаптация клеток к гипоксии не сопровождается увеличением устойчивости опухолевых клеток к действию апоптотических факторов. Взятые вместе, полученные результаты могут послужить основой для развития и совершенствования методов адьювантной терапии опухолей, в том числе комбинированной терапии с использованием антиангиогенных и химиопрепаратов. ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Гнпоксический синдром i viv и i vi. Классификация гипоксических состояний. Гипоксия широко распространенное явление, возникающее как в условиях дефицита кислорода во внешней среде, так и в результате разных патологических состояний, связанных с нарушением функций дыхательной, сердечнососудистой систем, а также транспортной функции крови. В конечном счете во всех случаях происходит снижение доставки кислорода к тканям до уровня, недостаточного для поддержания функции метаболизма и структуры клетки. Это определяет актуальность проблемы в целом и ее значимость для практической и теоретической медицины. Проявления гипоксии существенно зависят от индивидуальной реактивности организма, степени, скорости развития и продолжительности гипоксического состояния, а также от его этиологии.