Изучение антигенных детерминант тиреоглобулина человека и животных с помощью моноклональных антител

• Автор: Пиневич, Агния Александровна
• Шифр специальности: 03.00.25, 14.00.36
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 142 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ТИРЕОГЛОБУЛИН СТРУКТУРА,

БИОСИНТЕЗ, ЭВОЛЮЦИЯ

1.1. Тиреоглобулии предшественник тиреоидных гормонов

структура и биосинтез.

1.1.1. Выделение, очистка и физикохимические свойства ТГ

1.1.2. Ген ТГ и его экспрессия

1.1.3. Структура молекулы ТГ

1.1.3.1. Аминокислотный состав и первичная структура молекулы И

1.1.3.2. Углеводная часть молекулы
1.1.3.3. Сульфатные и фосфатные группы
1.1.3.4. Содержание йода йодированные аминокислоты.
1.1.3.5. Трехмерная структура молекулы
1.1.4. Биосинтез и превращения ТГ.
1.1.4.1. Синтез белковой части ТГ.
1.1.4.2. Постгрансляционные модификации и созревание ТГ.
1.1 Йодирование ТГ и образование йодтиронинов
1.1.4.4. Компактизация и хранение ТГ
1.1 Импорт ТГ в тиреоциты .
1.1.4.6. Протеолиз ТГ и образование тиреоидных гормонов
1.1.4.7. Контроль образования тиреоидных гормонов механизмы обратной
регуляции.
1.2. Структу ра ТГ животных и его эволюционное происхоздеине
1.2.1. Структура ТГ животных
1.2.2. Гомология ТГ с другими белками и эволюционное происхождение
1.3. ТГ как антиген.
1.3.1. Получение МКАТ против ТГ.
1.3.2. Изучение эпитопов ТГ человека и животных при помощи МКАТ
1.3.2.1. Эволюционно консервативные и видоспецифические антигенные
детерминанты молекулы ТГ
1.3.2.2. Йодирование ТГ и его влияние на иммуногенность выявление
гормоногенных участков молекулы ТГ при помощи МКАТ
1.3.2.3. Конформационные и линейные антигенные детерминанты молекулы
1.3.2.4. Картирование линейных эпитопов молекулы ТГ.
1.3.3. Иммуногистохимическое исследование ТГ человека и животных
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Реагенты.
2.2. Животные.
2.3. Антигены.
2.3.1. Денатурация ТГ.
2.4. Антитела н их производные
2.5. Методы твердофазного иммуноферментного анализа.
2.5.1. Характеристика препаратов МКАТ против ТГ.
2.5.2. Исследование перекрестной реактивности МКАТ
2.5.2.1. Исследование перекрестной реактивности МКАТ с ТЗ и Т4
2.5.2.2. Исследование перекрестной реактивности МКАТ с АХЭ
2.5.2.3. Исследование перекрестной реактивности МКАТ с ТГ животных
2.5.3. Изучение конформационно зависимых и линейных эпитопов ТГ
2.6. Иммуногистохимическос исследование.
2.6.1. Образцы ткани
2.6.2. Контроли специфичности иммуногистохимического окрашивания
2.6.3. Иммуногистохимическое выявление ТГ.
2.7. Статистический анализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Характеристика препаратов МКАТ против ТГ.
3.1.1. Определение титров МКАТ против ТГ
3.1.2. Изотипирование МКАТ
3.2. Изучение перекрестной реактивности МКАТ с ТЗ, Т4 и АХЭ
3.3. Исследование эпитопной специфичности МКАТ
3.4. Изучение перекрестной реактивности МКАТ с ТГ животных.
3.4.1. Изучение перекрестной реактивности МКАТ методом ИФА
3.4.2. Иммуногистохимическое изучение ТГ с помощью МКАТ.
3.4.2.1. Изучение возможности применения МКАТ в
иммуногистохимических исследованиях.
3.4.2.2. Контроли специфичности иммуногистохимического окрашивания
3.4.2.3. Изучение перекрестной активности МКАТ
иммуногистохимическими методами.
3.5. Анализ специфичности МКАТ в группах взаимного
ингибирования.
3.6. Эволюциоино консервативные и видоспецифические эпитопы .
ТГ животных.
3.7. Выявление конформационно зависимых и линейных эпитопов
3.7.1. Выявление конформационно зависимых и линейных эпитопов ТГ
человека путем восстановления дисульфидиых связей молекулы.
3.7.2. Выявление конформационно зависимых и линейных эпитопов ТГ
человека путем температурной денатурации молекулы.
3.7.3. Выявление конформационно зависимых и линейных эпитопов ТГ
животных.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Выделение мРНК ТГ позволило осуществить синтез различных специфических зондов комплементарной ДНК кДНК и с их помощью исследовать внутриклеточную локализацию мРНК, а также изучить ген ТГ и первичную структуру белка . С помощью метода гибридизации i i было показано, что в среднем на один тиреоцит в нормальной ткани щитовидной железы приходится 2x3 копий мРНК ТГ, причем это число может различаться как в пределах фолликула, так и между фолликулами в зависимости от функционального состояния клеток . У человека мРНК ТГ имеет размер 8,5 т. Знетранслируемая последовательность, размер которой варьирует от 1 до 0 п. Ген, кодирующий ТГ, присутствует в виде одной копии на гаплоидный геном. В г. ТГ человека локализован на 8й хромосоме v . Позже путем метода гибридизации i i плазмидной ДНК, содержащей фрагмент 5концевой части гена ТГ, с метафазными препаратами лимфоцитов человека было установлено, что ген ТГ человека расположен в дистальной части длинного плеча 8й хромосомы 8. Ген ТГ человека имеет размер 0 т. ТГ, состоящий из аминокислотных остатков АКО . V . Помимо основного продукта сплайсинга мРНК ТГ человека, было также обнаружено продуктов альтернативного сплайсинга. Предполагается, что полипептиды, кодируемые этими продуктами, вносят вклад в микрогетерогеиность ТГ . Транскрипция гена ТГ происходит при участии ряда белков. Для осуществления транскрипции гена ТГ требуется совместное действие по крайней мере трех транскрипционных факторов, которые также принимают участие в транскрипции генов тиреоидной пероксидазы ТПО и натри ййод и дсимпортера I i . Это I1 в прошлом , сокр. X1 в прошлом 2, сокр. X8 сокр. I i . Показано, что фолликулярный ТГ способен подавлять экспрессию генов транскрипционных факторов I, X1 и РАХ8, причем этот эффект не может быть вызван только действием тиреоидных гормонов или йода. Это, в свою очередь, вызывает снижение синтеза ТГ, ТПО, рецептора ТГГ и I. Данный механизм опосредован связыванием ТГ с рецепторами асиалогликопротсинов. Предполагается, что такой механизм регуляции является нормальным компенсаторным механизмом обратной связи, ограничивающим функции фолликулов и обеспечивающим их гетерогенность i . Аминокислотный состав и первичная структура молекулы Продукт трансляции гена ТГ, белокпредшественник, состоит из сигнального пептида из АКО, за которым следует ТГ, состоящий из АКО i, ii, . У человека, как и у большинства других видов млекопитающих, в молекуле ТГ преобладают остатки глутаминовой кислоты ,1, серина 9,7 и лейцина 9,5, а минорными являются остатки гистидина 1,4 и метионина 1,4 i, i, , V, . Общее содержание гидрофобных и гидрофильных АКО для ТГ человека составляет ,7 и ,3, а содержание кислых и основных АКО ,5 и ,7 соответственно , V, . Число остатков цистеииа, образующих внутри и межмолекулярные дисульфидные связи в молекуле ТГ, составляет 0 . ТГ человека , V, . ТГ состоит из обычных аминокислот, за исключением того, что в нем пристствуют йодированные производные. Учитывая функциональную роль ТГ как предшественника тиреоидных гормонов, можно было предположить, что его молекула содержит большое количество остатков тирозина. Однако содержание этой аминокислоты составляет 2 2,5 для ТГ человека i, . Было показано, что ТГ обладает сложной внутренней структурой рис. В концевой части молекулы ТГ АКО 1. Описано три типа повторяющихся доменов, для которых положение остатков цистеина, а также части остатков пролина и глицина является высоко консервативным. В случае ТГ человека, домены первого типа длиной АКО повторяются раз в пределах остатков 1 В этой области также имеются вставки различной длины, их местоположение фиксировано, но они не имеют гомологии с повторяющимися доменами. Домены второго типа состоят из АКО, трижды повторяющихся между положениями . ТГ человека. Между позициями . Ii и И1Ь, которые повторяются пять раз, причем за дважды повторяющимися остатками Ша и ШЬ следует копия остатка Ша. В отличие от концевой части молекулы ТГ, Сконцевая часть представляет собой последовательность из 0 АКО, не обладающую внутренней гомологией. В этой части молекулы содержание остатков цистеина ниже, а остатков тирозина выше по сравнению с их содержанием во всем мономере . Vi .