Эпитопное картирование С-концевого домена ангиотензин-превращающего фермента человека

• Автор: Наперова, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.23, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 151 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. МЕТОДЫ ЭПИТОПНОГО КАРТИРОВАНИЯ.

1.1. Общая характеристика антител и антигенов

1.2. Определение эпитопов связывания моноклональных антител методами , i , ix .

1.3. Использование фаговых библиотек

1.4. Определение антигенных детерминант с помощью массспектрометрии.

1.5. Сайтнаправленный мутагенез

1.6. Определение кристаллической структуры комплексов антигенантитело

2. АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩИЙ ФЕРМЕНТ

2.1. Физиологическая значимость ангиотензинпревращающего фермента

2.2. Структура ангиотензинпревращающего фермента.
2.3. Гликозилирование ангиотензинпревращающего фермента
2.4. Трехмерная структура доменов ангиотензинпревращающего фермента .
3. ЭПИТОПНОЕ КАРТИРОВАНИЕ МОЛЕКУЛЫ АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.
3.1. Предсказание эпитопов связывания моноклональных антител на поверхности доменов АПФ с помощью метода
3.2. Выявление антигенных детерминант на поверхности ангиотензинпревращающего фермента
3.3. Локализация эпитопов связывания моноклональных антител, специфичных к домсиу ангиотензинпревращающего фермента.
3.3.1. Локализация эпитопа связывания мАт ЗАЗ.
3.3.2. Локализация эпитопа связывания мАт 9В9.
3.3.3. Локализация эпитопов связывания мАт
3.3.4. Локализация эпитопов связывания мАт i, 1 и 6А
3.3.5. Локализация эпитопа связывания мАт .
3.4. Использование моноклональных антител к домсну при изучении структуры и функционирования ангиотензинпревращающего фермента
3.4.1. Исследование возможной связи между димеризацией и шедцингом ангиотензинпревращающего фермента с поверхности клеточных мембран
3.4.2. Изучения каталитической активности Мдомена ангиотензинпревращающего фермента
3.4.3. Изучение конформационных изменений соматического ангиотензинпревращающего фермента при взаимодействии с ингибитором
3.5. Картирование эпитопа связывания моноклональных антител .
3.5.1. Локализация эпитопов связывания моноклональных антител 1ВЗ
3.5.2. Использование моноклональных антител 1ВЗ
3.6. Эпитопиое картирование денатурированного тАПФ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Материалы.
4.2. Методы
4.2.1. Выделение и очистка соматического ангиотензинпревращающего фермента.
4.2.2. Выделение и очистка тестикулярного ангиотензинпревращающего фермента.
4.2.3. Фазовое разделение ангиотензинпревращающего фермента в присутствии тритона Х
4.2.4. Определение активности ангиотензинпревращающего фермента
4.2.5. Определение концентрации активных центров ангиотензинпревращающего фермента.
4.2.6. Модификация ангиотензинпревращающего фермента
4.2.7. Подбор оптимальных концентраций фермента и моноклональных антител для иммуносорбции
4.2.8. Характеристика связывания моноклональных антител с разными формами ангиотензинпревращающего фермента.
4.2.9. Определение констант связывания моноклональных антител с тестикулярным ангиотензинпревращающим ферментом.
4.2 Выявление моноклональных антител, обладающих ингибирующей активностью по отношению к тестикулярному ангиотензин
ревращающем у ферменту
4.2 Определение конкуренции моноклональных антител за связывание с ангиотензинпревращающим ферментом
4.2 Эпитопное картирование поверхности Сдомена АФ
4.2 Оценка площади поверхности фермента, покрываемой олигосахаридом
4.2 Моделирование открытой конформации Сдомена ангиотензиипревращающего фермента
4.2 1.
4.2 Построение модели двудоменного ангиотензинпревращающего фермента
4.2 Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5. ОПРЕДЕЛЕИЕ КОНКУРЕНЦИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ЗА СВЯЗЫВАНИЕ С СДОМЕНОМ АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
5.1. Подбор оптимальных условий для иммуносорбции.
5.2. Определение связывания панели моноклональных антител с тестикулярным ангиотензинпревращающим ферментом
5.3. Определение констант диссоциации комплексов моноклональных антител с тестикулярным ангиотензинпревращающим ферментом
5.4. Определение конкуренции моноклональных антител за связывание с тестикулярным ангиотензинпревращающим ферментом
6. ЭПИТОПНОЕ КАРТИРОВАНИЕ СДОМЕНА I II ИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕ1I
6.1. Сравнение связывания моноклональных антител с ангиотензинпревращающим ферментом из различных организмов
6.2. Сравнение связывания моноклональных антител с химерами и мутантами ангиотензинпревращающего фермента
7. МОДЕЛИРОВАНИЕ ОТКРЫТОЙ КОНФОРМАЦИИ СДОМЕНА АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА
8. ПРЕДСКАЗАНИЕ СТРУКТУРЫ ДВУДОМЕННОГО АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА
9. ВЛИЯНИЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ НА СВЯЗЫВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩИМ ФЕРМЕНТОМ.
9.1. Моделирование углеводных остагков на поверхности молекулы ангиотензинпревращающего фермента
9.2. Определение связывания моноклональных антител с ангиотензинпревращающим ферментом из различных тканей и биологических жидкостей.
9.3. Дссиалирование и дегликозилирование ангиотензинпревращающего. фермента
9.4. Выявление сайтов гликозилирования ангиотензинпревращающего фермента с помощью МАХНТОР массспектрометрии.
. СВЯЗЫВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С АНГИОТЕНЗИН
ПРЕВРАЩАЮЩИМ ФЕРМЕНТОМ ПРИ РАЗВИТИИ ПАТОЛОГИИ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В молекуле иммуноглобулина любого класса легкие цепи относятся только к одному типу. Все легкие и тяжелые цепи имеют одну принципиальную структурную особенность они состоят из двух частей вариабельной и константной. Вариабельные части легких цепей, располагающиеся на МНгконце цени, сильно отличаются друг от друга у всех исследованных иммуноглобулинов, а константные, располагающиеся в СООНконцевой части цепи, имеют близкую аминокислотную последовательность в пределах одного класса как легких, так и тяжелых цепей. Вариабельная область тяжелых цепей в ЫГЬконцевой части несколько длиннее соответствующей областилегких цепей. Вариабельные части тяжелых и легких цепей содержат гиперварнабольные участки, в которых частота замен отдельных аминокислотных остатков максимальна. Эти участки принимают непосредственное участие при связывании антигена и входят в состав антигенсвязывающего центра. Существуют поликлональные и моноклональные антитела мАт. Поликлональные антитела являются гетерогенной смссыо антител, направленных к разным эпитопам связывания антигена, и различающихся как но специфичности, аффинности, так и по физикохимическим свойствам. Для получения поликлональных антител проводят иммунизацию животного антигеном, которое является донором иммунной сыворотки антисыворотки. Гак как иммунный ответ формируется в организме постепенно, приянто различать первичный ответ после первого введения антигена и вторичный после повторых инъекций антигена. Первичные и вторичные антисыворотки отличаются но составу антител и их специфичности. Обычно высокоактивные антисыворотки получают после нескольких циклов иммунизации. Полученная иммунная сыворотка содержит поликлональные антитела, специфичные к исследуемому антигену. Для получения мАт используется слияние мисломных клеток с клетками селезенки иммунизированного животного, таким образом, гибридные клетки гибридомы наследуют от опухолевых клеток способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки синтезировать антитела предполагаемой специфичности . В отличие от поликлональных антител, содержащих большое разнообразие антител, отличающихся своей специфичностью, аффинностью и физикохимическими свойствами, препараты моноклональных антител содержат продукт единственного клона плазматических клеток, направленный к строго определенной антигенной детерминанте и обладающий всегда одинаковыми физикохимическими характеристиками и сродством к антигену. Цель эпитопиого картирования установление эпитопа связывания антитела на поверхности молекулы антигена. Эпитоп нос картирование используют для изучения специфичности антител, белокбелковых взаимодействий, для исследования специфики иммунного ответа. Существует несколько подходов определения антигенных детерминант белков, причем такие методы, как пептидное сканирование, методы, включающие в себя экспрессию пептидных фрагментов на поверхности бактериофагов . Методы, включающие в себя экспрессию 5ти, 7ми ил тичленных пептидов, а также небольших белков на поверхности бактериофагов, точечный мутагенез, массспектрометрия, сравнение связывания антител с гомологичными белками, кристаллизация комплексов антигенантитело позволяют определять конфирмационные эпитопы связывания антител на поверхности антигенов. Метод вариант твердофазного пептидного синтеза был впервые предложен в работе . Он представляет собой одновременный синтез несколько сотен пептидов, а затем иммунохимичсский анализ ковалентно связанных с пластиковыми пинами пептидов на предмет связывания с мДт. Эта технология имеет большие преимущества для эпитопиого картирования, так как можно синтезировать огромное количество перекрывающихся по последовательности пептидов, а также можно использовать данные пептиды во многих экспериментах I с различными антителами. Пины для пептидного синтеза организованы в матрицах, состоящих из 8x ячеек, соответствующих коммерчески доступным планшетам. Такая геометрия позволяет просто и быстро проводить твердофазный иммуноферментный анализ I для детекции специфичных антител.