Получение рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris

• Автор: Бобик, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Синтез и структура человеческого сывороточного альбумина

Свойства и функции ЧСА.

Связывание лигандов...

Антиоксидантные свойства ЧСА.

Энзиматические свойства ЧСА

Области и стратегии применения препарата ЧСА .

Получение рекомбинантного ЧСА в различных системах экспрессии ло

Экспрессия рЧСА в прокариотических системах ii i и i
ii
Экспрессия рЧСЛ в дрожжах vii
Экспрессия рЧСА в дрожжах v i .
Экспрессия рЧСА в метипотрофных дроэгсжах ii

Система экспрессии рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжах ii
i
Преимущества системы экспрессии . i
Генетические основы экспрессии белков дроэсэсами . i
Экспрессия рекомбинантного ЧСА в дрожэсах . i
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Создание экснрессиониого штамма 5ЧСА .
Подбор оптимальных условий аналитической экспрессии.
Оптимизация экспрессии целевого белка в условиях культивирования в
ферментере .
Создание экспрессионного штамма 5ЧСА2
Очистка рЧСА из культуральной среды
Структурнофункциональные исследования рЧСА
Исследования биологической активности препарата рЧСА
ВЫВОДЫ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Химические реактивы и сопутствующие материалы
Методы работы с бактериями ii i
Методы работы с дрожжами ii i . .
Работа с нуклеиновыми кислотами
Хроматографические процедуры . .
Работа с белками. .
Массспектрометрический анализ. юз
Эксперименты с участием лабораторных животныхЮ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ЧСА содержит в своей аминокислотной последовательности остатков цистеина, из которых замкнуты в дисульфидных связей, стабилизирующих третичную структуру альбумина. Свободная группа цистеина обеспечивает около восстановительного потенциала плазмы крови и доступна для ацилирования ЧСА и нитрозилирования ЧСА при некоторых функциях i viv. В физиологических условиях ЧСА в основном находится в восстановленной форме, называемой меркаптоапьбумином. Тем не менее, небольшая часть альбумина менее представлена в виде смеси дисульфидов ЧСА, где представляет собой низкомолекулярные, тиолсодсржащие вещества плазмы, такие как цистеин и глутатион 4. Формирование димеров 44 теоретически возможно, но не происходит i viv изза стерического ограничения. Тем не менее, формирование димеров альбумина имеет место x viv в процессе очистки и хранения. Рис. Схематичное изображение молекулы ЧСА. Субдомены выделены 1а желтым, зеленым, На красным, НЬ розовым, Ша синим, I голубым. и Сконцевые части молекулы обозначены и С соответственно. ЧСА синтезируется в виде препроальбумина в полисомах гепатоцитов гдень, что составляет около от суммарного белка, продуцируемого печенью. Синтез белка в клетках является постоянным процессом, регулируемым как на уровне транскрипции, так и на уровне посттранскрипциональных модификаций. Синтез альбумина повышается под действием соматотропного, адренокортикотропного гормонов, инсулина, кортикостероидов, тестостерона. Альбумин является преимущественно внеклеточным белком более альбуминов в организме находятся вне сосудистого русла. В плазме крови содержится около альбумина, остальная часть представлена его обменными депо в тканях, преимущественно в коже , а также в мышцах и органах . При изучении катаболизма радиоактивно меченого альбумина у здоровых людей выявлено, что период полураспада составляет в среднем ,8 дней 7. Гольджи, где с помощью Са зависимой диаргинил специфической коивертазы отщепляется пропептид V 9. Зрелый белок с концевой аминокислотной последовательностью iсекретируется в кровеносный поток 3. Ген, кодирующий ЧСА, представлен в геноме одной копией , расположен на четвертой хромосоме в локусе и содержит экзонов и нитронов. Он отличается высоким полиморфизмом, и в настоящее время известно более генетических вариантов ЧСА аллоальбумины . Более двадцати вариантов альбумина, содержащего единичные точечные замены . Серия генетических вариантов проальбумина. Некоторые точечные мутации в пропептиде или около полностью блокируют процессинг пропептида, что приводит к тому, что около общего альбумина находится в форме пропептида. Например, проальбумин i аргинин в позиции 1 заменяется глутамином i , , , и i 2 i . Некоторые мутации блокируют процессинг не полностью, и в результате доля проальбумина составляет 3 от общего альбумина. Проальбумин i V, представлен в очень малом количестве, а основным продуктом является альбумин i V . Ген проальбумина i содержит две мутации 2 , 0А1а , но соответствующий проальбумин не обнаруживается в плазме. Альбумин i, циркулирующий в кровотоке представляет собой аргинилальбумин с заменой 0 аминокислоты 0А1а . Этот продукт содержит сайт гликозилирования , что приводит к присоединению глюкозоамингликана к 8 . Свойства и функции ЧСА. ЧСА мультифункциональный белок, обладающий лигандсвяывающими и антиоксидантными свойствами, а также энзиматическими активностями. Основная роль альбумина участие в поддержании коллоидноосмотического онкотического давления плазмы и объема циркулирующей крови, а также транспорт и депонирование различных веществ. Альбумин обеспечивает онкотического давления плазмы крови, что связано с его относительно малой молекулярной массой и большим количеством молекул в плазме крови .