Ca2+-регулируемый фотопротеин обелин и его производные как репортеры в биолюминесцентном анализе in vitro

• Автор: Борисова, Василиса Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Условные обозначения

ГЛАВА 1. Использование кальцийрегулируемых фотопротеинов в качестве репортеров в диагностики i vi

1.1. Использование Са2регулируемых фотопротеинов в иммунофермен гном анализе

1.2. Использование Сарегулируемых фотопротеинов в гибридизационном анализе

1.3. Одновременный анализ двух мишеней

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1. Оборудование

2.2. Материалы и реактивы

2.3. Культивирование трансформированных клеток . i, выделение и очистка белков

2.4. Определение концентрации белков, биолюминесцентной активности и спектральные измерения
2.5. Химическая модификация белков и олигонуклеотидов ГЛАВА 3. Одновременный иммуноферментный анализ двух антигенов с использованием цветных мутантных форм обслина в качестве меток
3.1. Основные физикохимические свойства мутантных форм
обелина и 8
3.2. Одновременный твердофазный иммуноанализ двух антигенов
ГЛАВА 4. Последовательный иммуноферментный анализ двух антигенов с использованием фотонротеина обелина в паре с целентеразинзависимой люциферазой ii
4.1. Основные физикохимические свойства люциферазы ii
4.2. Использование люциферазы в твердофазном микроанализе
ГЛАВА 5. Гибридизационный биолюминесцентный анатиз с использованием фотопротеина обелина
5.1. Гибридизационный анализ с использованием в качестве метки коньюгата стрептавидина с обелином или
щелочной фосфатазой
5.2. Гибридизационный анатиз с использованием в качестве метки коньюгата олигонуклеотидного зонда с обелином
или его мутантными вариантами 8 и
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Присоединение ионов Са практически мгновенно вызывает реакцию внутримолекулярного окислительного декарбоксилирования субстрата с образованием целентерамида, С и испусканием кванта света в голубой области. Благодаря этому свойству фотопротеины успешно используются для мониторинга внутриклеточного Са2 более лет. Клонирование кДНК генов ряда фотопротеииов и получение высокоактивных рекомбинантных белков в практически неограниченном количестве открыло новые возможности их применения, в частности, в качестве репортеров в гибридизационном и иммунном анализах. ОЬеНа Ьпжипа выделен и изучен природный белок, клонирована его кДНК, получен штаммсупсрпродуцент и разработана эффективная технология получения рекомбинантного обелина, установлена его пространственная структура и предложен механизм биолюминесцентной реакции. На основе этих данных сайтнаправленным мутагенезом были сконструированы ряд мутантов обелина, обладающих уникальными свойствами, в том числе и новыми спектральными характеристиками излучения. Таким образом, появилась возможность использования мутантных форм обелина в качестве меток для одновременного определения нескольких аналитов и регистрацией сигналов на разных длинах волн. Одной из задач клинической иммунодиагностики является определение не только количества, но и баланса между содержанием двух антигенов соотношения ЛГ и ФСГ, тироидных гормонов трийодтиронина, тироксина, а также их свободных и связанных форм анализ ряда гормонов и белковпереносчиков, в норме присутствующих в кровяном русле и т. Одновременный анализ содержания нескольких антигенов позволит избежать ошибок изза разнесенных во времени процедур определения, а также существенным образом сократит временные и материальные затраты на такую диагностику, что особенно важно при проведении широкомасштабных исследований. Другим видом молекулярной диагностики является метод, основанный на определении определенных нуклеотидных последовательностей с помощью ДНКгибридизации. В литературе имеются данные о перспективности использования фотопротеина акворина в качестве репортерного белка в таком анализе. Исследований по применению рекомбинантного обелина для этих целей не проводилось. Целью представленной работы являлось разработка вариантов биолюминесцентного иммуноанализа, позволяющих проводить определение двух антигенов в одном образце, а также вариантов ДНКгибридизационного анализа с применением фотопротеина обелина в качестве репортера. ii изучить ее основные свойства и синтезировать коныогаты люциферазы, пригодные для использования в качестве биолюминесцентной метки в иммуноферментном анализе. ii . Синтезировать коныогаты обелина с авидином или стрептавидином и исследовать их эффективность в качестве меток в твердофазном гибридизационном анализе. ПЦР. Разработан вариант одновременного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием цветных мутантных форм обелина в качестве репортерных белков и регистрацией сигналов на разных длинах волн. Разработан метод иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием двух разных биолюминесцентных репортеров фотопротеина обелина и целентеразинзависимой люциферазы ii с последовательным запуском биолюминесцентных реакций. Показана перспективность использования фотопротеипа обелина как репортера в гибридизациониом анализе в различных форматах. Все результаты данной работы получены впервые и могут быть использованы для создания отечественных высокоэффективных и чувствительных биолюминесцентных диагностикумов для определения биологически важных соединений и инфекционных агентов. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 6офи, I 4 гг. М.И. Вавилова Киев, Украина, , международной конференции молодых ученых Биотехнология будущего СанктПетербург, , международном семинаре молодых ученых Нуклеиновые кислоты как мишени и инструменты Новосибирск, . По результатам исследования опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах и 2 статьи в сборниках материалов международных конференций.