Получение препарата грибной β-галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности

• Автор: Сухих, Ольга Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 177 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 ргалактозидаза и источники ее получения.

1.2 Механизм действия ргалактозидазы

1.3 Свойства ргалактозидаз из различных источников

1.4 Выделение и очистка Ргалактозидаз.

1.5 Применение препаратов Ргалактозидазы

1.6 Анализ обзора литератры и задачи исследований

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Методы выделения и очистки фермента
2.2 Методы определения ферментативной активности.
2.3 Методы химических анализов.
2.4 Методы определения степени чистоты препарата.
2.5 Определение молекулярной массы.
2.6 Определение изоэлектрической точки.
2.7 Определение оптимальных условий действия и стабильности фер
2.8 Определение влияния различных реагентов на активность ргапак
тозидазы.
2.9 Определение кинетических констант гидролиза субстратов.
2. Определение специфической активности ргалактозидазы
2. Определение микробиологической чистоты препарата
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Исследование ферментативного комплекса исходного препарата
Лактоканесцин.
3.2 Выделение и очистка Ргалактозидазы из исходного комплексного препарата
3.2.1 Изучение стабильности Ргалактозидазы в водном растворе
3.2.2 Разработка способа очистки ргалактозидазы методом ультрафильтрации
3.2.3 Очистка концентрата от микрофлоры методом микрофильтрации .
3.2.4 Разработка способа очистки ргалактоидазы от протеиназы
3.3 Технологическая схема получения лекарственной субстанции препарата Галактозим и ее апробация .
3.4 Разработка способа получения высокоочищенной Ргалактозидазы ферментстандарта
3.4.1 Выбор условий предварительной очистки фермента.
3.4.2 Выбор оптимальных условий хроматографического процесса
3.4.3 Обессоливание и концентрирование элюата
3.4.4 Исследование способов разделения а и Ргалактозидаз.
3.5 Определение степени чистоты препаратов ргалактозидазы
3.6 Изучение физикохимических и каталитических свойств Ргалак
тозидазы
3.6.1 Влияние среды на активность фермента
3.6.2 Влияние температуры на активность ргалактозидазы
3.6.3 Влияние ионов металлов и специфичесих реагентов на активность Ргалактозидазы.
3.6.4 Оределение молекулярной массы
3.6.5 Определение изоэлектрической точки.
3.6.6 Определение кинетических характеристик Ргалактозидазы
3.6.6.1 Определение константы Михаэлиса
3.6.6.2 Определение характера ингибирования и константы ингибирования галактозидазы продуктами гидролиза.
3.7 Изучение специфического действия галактозидазы.
3.7.1 Изучение динамики гидролиза лактозы в молочных продуктах препаратом Галактозим.
3.7.2 Разработка готовой лекарственной формы препарата Галактозим и изучение его эффективности в условиях, имитирующих среду организма
3.7.2.1 Изучение некоторых фармакологических свойств готовой лекарственной формы препарата Г алактозим
3.7.2.2 Сравнение эффективности действия препаратов Галактозим и Лактраза на лактозу молочных продуктов
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Самая высокая активность ргалактозидазы среди этой группы микроорганизмов была найдена у i, i, i vi, i i и др. Наиболее полно и всесторонне изучена галактозидаза ii i, ставшая классической моделью при изучении механизма регуляции синтеза ферментов, а также в молекулярнобиологических и генетических исследованиях ii . Галактозидаза ii i, выпускаемая рядом зарубежных фирм в высокоочшценном виде, предназначена для научных исследований. В пищевой промышленности ее использование запрещено, т. В последние годы интенсифицировались рабогы по генной инженерии с целью увеличения биосинтеза фермента. Проведено клонирование гена, кодирующего высокостабильную галактозидазу i i, в культуру i ii с увеличением выхода фермента в раз i . Высокая активность галактозидазы обнаружена и во многих дрожжевых культурах, среди которых перспективными продуцентами являются v ii, v i и ряд других микроорганизмов Фениксова и др. Фениксова и др. В качестве продуцентов галакгозидазы используются дрожжи родов i, i I . Так, термотолерантный штамм дрожжей рода i, растущий на средах с высоким содержанием лактозы до , синтезирует галакгозидазу с активностью едмл. Однако дрожжи этого рода в нашей стране применяются только для кормовых целей. Бактерии и дрожжи образуют внутриклеточную галактозидазу, для выделения которой требуется дополнительная стадия разрушения клеточной стенки и извлечения фермента, что усложняет технологический процесс и приводит к увеличению потерь конечного продукта. Широко исследовались галактозидазы из , однако этот продуцент признан неперспективным для практического использования вследствие необычайной легкости его спор , , . Известны в качестве продуцентов микроскопические грибы рода i ii i, i, i . Интересно, что продуцент целлюлолитического комплекса ферментов гриб i i при росте на лактозе в непрерывном режиме культивирования образует внеклеточную галактозидазу i . Пастор и Парк , Раге, обнаружили, что среди выделенных из почвы штаммов грибов 5 штаммов, относящихся к родам i, ii и i, способны продуцировать внеклеточную галактозидазу на среде с пшеничными отрубями. Японскими исследователями детально изучены широко применяемые в промышленности галактозидазы из i i, i , i i заявки Японии, ,,. Проводился поиск продуцентов галактозидазы среди термофильных микроорганизмов, способных расти при температуре С на среде с единственным источником углерода лактозой. Был выделен штамм i , i, , продуцирующий термостабильную галактозидазу, которая могла быть использована для обработки молока во время пастеризации. В результате широкого поиска продуцентов фермента, проведенного в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, были найдены новые продуценты галактозидазы i i и vi ii Загустина и др. Жукова и др. Японии, заявка Японии, Билай и др. Для iii было показано, что на среде со свекловичным жомом или с соевой мукой в качестве источника углерода на долю внеклеточной Ргалактозидазы, активность которой может достигать едмл питательной среды, приходится до всех синтезируемых клеткой белков Билай и др. Югова, Николаев, Николаев и др. Микроскопический гриб iii является наиболее активным среди отечественных продуцентов грибных ргалактозидаз и может с успехом использоваться для производства этого фермента. РГалактозидаза катализирует гидролиз терминальных гликозидных связей, отщепляя остатки галактозы с нередуцирующего конца субстратов с сохранением их конфигурации. Субстратом для Ргалактозидазы являются галактозиды, включая лактозу и ее производные. Расщепление идет между атомом моносахаридного остатка и гликозидным атомом кислорода. Формально гидролиз может быть представлен как нуклеофильное замещение при аномерном центре гликоновой отщепляемой части субстрата. Для характеристики каталитического действия гликозидаз обширную информацию дает изучение специфичности ферментативного действия по отношению к различным субстратам. Галактозидаза проявляет высокую специфичность по отношению к конфигурации гидролизуемой связи и к структуре гликона. Изменение пиранозной формы гликона на фуранозную изменяет сродство фермента к субстрату настолько, что гидролиз прекращается.