Экстрахромосомные ДНК дрожжей-сахаромицетов

• Автор: Аверьянов, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 1983 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. 2мкм ДНК дрожжейсахаромицетов.II

2.1.1. Структура и физикохимические свойства дрожжевой плазмидыII

2.1.2. Внутриклеточная локализация 2мкм ДНК

2.1.3. Репликация 2мкм ДНК

2.1.4. функциональное значение 2мкм ДНК .

2.2. Экстрахромосомная рДНК Змкм ДНК дрожжей .

2.3. Митохондриальная ДНК дрожжейсахаромицетов. . .

2.4. Генетическая трансформация дрожжей

3. Материалы и методы исследований .
3.1. Микробиологические методы . .
3.1.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования бактерий.
3.1.2. Трансформация бактериальных меток .
3.1.3. Дрожжевые штаммы и условия культивирования дрожжей
3.1.4. Трансформация дрожжей.
3.2. Биохимические методы.
3.2.1. Выделение тотальной дрожжевой ДНК .
3.2.2. Выделение суперспирализованной дрожжевой
3.2.3. Выделение бактериальной плазмидной ДНК .
3.2.4. Раскапывание градиентов и подготовка к определению радиоактивности исследуемого материала
3.2.5. Фракционирование ДНК в градиентах нейтрального хлористого цезия
3.2.6. Синтез комплементарной радиоактивной РНК
3.2.7. РНКДНК гибридизация . .
3.2.8. Рестрикция ДНК и лигирование рестрикционных фрагментов.
3.2.9. Электрофорез ДНК в агарозном геле . .
3.2 Определение концентрации ДНК спектрофлюорометрическим методом .
3.2 Фракционирование РНК электрофорезом
3.2 Фотографирование флюоресцирующей ДНК
3.2 Определение радиоактивности препаратов .
4. Результаты исследований
4.1. Выделение ковалентнозамкнутых ДНК дрожжей. .
4.2. Рестрикционный анализ 2мш ДНК
4.3. Исследование сравнительного содержания 2мкм
4.3.1. Очистка ДНКазы от РНКазных примесей. .
4.3.2. Получение и очистка транскрппта 2мкм
4.3.3. Определение зависимости уровня гибридизации от количества ДНК на фильтре . .
4.3.4. Определение влияния избытка гетерологичной ДНК на уровень гибридизации 3НкРНК.
4.3.5. Определение содержания 2мкм ДНК в различных штаммах дрожжей
4.4. Определение природы минорной фракции ДНК в препаратах кольцевых ковалентнозамкнутых молекул .
4.4.1. Очистка и определение плавучей плотности минорной фракции кз ДНК.
44.2. Гибридизация кзДНК с Нтранскриптом
4,4.3. Электронная микроскопия легкой фракции кзДНК ЭХ
4.5. Конструирование двухрепликонной дрожжевой
плазмиды . .
4.5.1. Конструирование плазмиды
4.5.2. Селекция и идентификация рекомбинантной плазмиды
4.5.3. Проверка трансформирующей активности и генетической стабильности плазмиды
в дрожжевых клетках.
5. Обсуждение результатов.
Выводы.
Литература


Недавно получены новые данные об успешной экспрессии синтетического гена интерферона человека в дрожжевой клетке , причем уровень продукции активного интерферона, синтезированного в дрожжевой клетке, значительно превышал уровень его синтеза в бактериальной системе. Дрожжисахаромицеты имеют ряд важных преимуществ перед другими возможными объектами в генноинженерных экспериментах. Вопервых, это наиболее изученный в генетическом отношении объект из эукариотических микроорганизмов. Наличие многочисленных генетических маркеров облегчает как конструирование векторых ДНК, так и контроль проведения генетической трансформации. Вовторых, огромный опыт использования дрожжейсахаромицетов в микробиологической практике, в том числе и в фармакологической и пищевой промышленности, показал их полную безвредность для человека и окружающей среды, что облегчает для этого объекта решение вопросов, связанных с проблемой потенциальной опасности работ с рекомбинантными ДНК и внедрением результатов научных разработок в практику. Третье преимущество дрожжевой системы обнаружилось в году, когда была продемонстрирована экспрессия клонированного дрожжевого гена i3 , кодирующего синтез имидазолглицерофосфатдегидратазы, в е. Позднее была получена экспрессия еще нескольких дрожжевых генов в клетках е. Это обеспечило первую необходимую основу для конструирования векторных ДНК генетические маркеры для отбора трансформированных дрожжевых клеток. Кроме того у дрожжей известны экстрахромосомные ДНК, которые содержат репликативные последовательности, обеспечивающие автономную репликацию плазмидных ДНК в дрожжевой клетке. Содержание ядерной хромосомной ДНК в гаплоидных клетках дрожжейсахаромицетов всего лишь в три раза выше, чем в клетке . Вся генетическая информация дрожжевой клетки представлена семнадцатью группами сцепления, что соответствует семнадцати хромосомам, на которых к настоящему моменту картировано около 0 генов 6. После того, как был описан метод генетической трансформации дрожжей , начался активный поиск векторных молекул, которые могли бы обеспечить активную репликацию и экспрессию эукариотических генов. Основой для таких генетических векторов могли служить природные молекулы ДНК дрожжей, способные к автономной репликации, то есть не входящие в состав какойлибо дрожжевой хромосомы. В настоящий момент для дрожжейсахаромицетов известно три типа экстрахромосомнш или плазмидных ДНК митохондриальная ДНК, автономно реплицирующийся комплекс рибосомальных генов или 3 мкм ДНК и критическая плазмида сахаромицетов 2 мкм ДНК, она же омикронная ДНК или . I.I. Структура и физикохимические свойства дрожжевой плазмиды. ДНК, она же омикронная ДНК или оДНК, впервые была обнаружена в году при электронномикроскопическом исследовании препаратов тотальной ДНК дрожжей группой Рабиновича 1. В г. ДНК удается получить из митохондриальномембранной фракции дрожжей . В г. Собственно 2 мкм средняя величина дрожжевой плазмиды, так как по данным различных авторов ее контурная длина варьирует от 1,8 до 2,2 мкм , , 1. Однако эти различия связаны не с истиным расхождением контурных длин, а с различиями в методах, используемых при их измерении в различных лабораториях . По многочисленным данным плавучая плотность оДНК в градиенте нейтрального хлористого цезия равна плавучей плотности ядерной ДНК дрожжей , 1, что составляет 1,8 гсм3. Так как оДНК внутри клетки находится в суперспирализованном состоянии, она легко могла быть выделена из клеточных лизатов дрожжевых клеток центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием, как это было предложено каа1о е а1 9. Цри анализе этих суперспирализованных ковалентно замкнутых молекул было показано, что их контурная длина равна 2 мкм , 1, откуда и название плазмиды. Кроме колец с контурной длиной 2 мкм были обнаружены молекулы длина которых в 2, 3 и более раз превышает длину изучаемой плазмиды . С помощью рестрикционного и гетеродуплексного анализа было показано, что эти молекулы являются олигомерами 2 мкм ДНК , 1. Содержание олигомеров в клетке как правило не превышает общего пула 2 мкм ДНК, причем девять десятых из них являются димерами, а на долю тримеров приходится, соответственно, 12 1.