Научные основы индуцированного синтеза алкалоидов в клеточной культуре CATHARANTHUS ROSEUS L.(DON)

• Автор: Величко, Надежда Александровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 306 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
Глава 1.Культура клеток и тканей растений как источник биологически активных соединений

1.1 .Каллусная ткань в изолированной культуре

1.2.Вторичный метаболизм в растениях i viv и i vi

1.2.1 .Продукты вторичного метаболизма в культуре ткани .

1.3.Условия и способы культивирования растительных клеток и синтез биологически активных веществ

1.3.1 .Физикохимические факторы среды

1.4.Элиситоры как индукторы вторичного метаболизма в клеточной культуре ткани

1.4.1 .Механизмы воздействия элиситоров на биосинтетические способности растительной клетки

1.4.2.Воздействие элиситоров на регуляцию метаболизма алкалоидов

1.5.Способы культивирования и их влияние на вторичный синтез в культуре ткани

1.5.1 .Культивирование интактных растений
1.5.2.Глубинное культивирование клеток растений в жидкой питательной среде суспензионные культуры
1.5.3.Культивирование иммобилизованных клеток
Выводы
Глава 2.0бъект и методы исследования
2.1 .Объект исследования
2.2.Введение в культуру .
2.3.Получение каллусных тканей .
2.4.Получение суспензионной культуры
2.5.Иммобилизация тканей . на инертный носитель
2.6.Методы оценки физиологического состояния культуры
2.7.0пределение содержания тяжелых металлов
2.8.Элиситоры в качестве биотического воздействующего фактора в культуре ткани .
2.9.0пределение содержания протеина в каллусных тканях .
2Определение флавоноидов в каллусной ткани . 2. .Определение сапонинов
2Количественное определение свободных аминокислот
2Определение суммарного содержания алкалоидов
2Разделение алкалоидов . высокоэффективной жидкостной хроматографией
2Определение содержания хлорофилла
2Определение ферментативной активности ферментов шикиматного пути хинатдегидрогеназы и шикиматдегидрогеназы
2Определение химического состава плодового тела гриба
2Методы исследования водных экстрактов древесной зелени
2Культивирование дереворазрушающего высшего гриба . на послеэкстракционном остатке каллусной ткани .
ГлаваЗ .Введение в культуру .
3.1.Получение интактных стерильных растений . в культуре i vi
3.2.Получение каллусной ткани и суспензионной культуры .
3.3.Влияние физикохимических параметров на процессы роста и развития каллусной ткани .
3.3.1 .Влияние уровня освещенности на процессы роста и развития каллусной ткани .
3.3.2.Влияние концентраций сахарозы на рост и развитие каллусной ткани .
3.3.3.Влияние инозита и гидролизата казеина на рост ткани и накопление алкалоидов
3.3.4.Влияние гормонального состава среды на рост и развитие каллусной ткани .
3.3.5.Влияние модуляторов вторичного метаболизма на активности ключевых ферментов шикиматного пути
3.3.6.Влияние минерального состава среды на рост и структуру каллусной ткани .
3.3.7.Влияние фосфатного компонента на рост каллусной ткани и накопление алкалоидов
Г лава 4.Способы получения клеточной культуры .
4.1 .Суспензионная культура .
4.2.Иммобилизация каллусной ткани . на пенополиуретановые пластины
4.3.Влияние способа культивирования на рост и развитие каллусной ткани .
Глава 5.Влияние элиситоров различной природы на биосинтетическую способность клеточной культуры .
5.1.Динамика роста и накопление индольных димерных алкалоидов в клеточной культуре . под действием элиситоров мицелиальных, дрожжевых грибов и хвойных экстрактов
5.2.Качественный и количественный состав свободных аминокислот в каллусной ткани .
5.3.Содержание биологически активных веществ в каллусной ткани . после элиситации
5.4.Активность ферментов шикиматного пути
5.5.Химический состав плодового тела гриба
.
5.6.Состав водных экстрактов древесной зелени сосны
5.7.Питательная среда на основе хвойного водного экстракта сосны
Глава б.Проблема регуляции и стратегии контроля процессов вторичного синтеза в культуре i vi
Глава 7.Технология получения алкалоидов из растительного сырья
7.1.Технологический процесс получения каллусной ткани и алкалоидов из каллусной ткани .
7.2.0птимизация процесса извлечения алкалоидов из каллусной ткани .
7.2.1.Химический состав каллусной ткани . после культивирования дереворазрушающего гриба

ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Высокие концентрации фосфата в большинстве случаев приводило к ухудшению роста культур и синтеза вторичных метаболитов. Их синтез начинается обычно после исчерпания фосфата из среды. Высокие концентрации фосфата в среде снижали синтез никотина в культуре клеток табака, антоцианов в культивируемых клетках моркови, фенолов в клетках чая. В то же время имеются сообщения об увеличении содержания вторичных соединений при повышении концентрации фосфата. Механизм действия фосфора по распределению субстрата между первичным и вторичным метаболизмом неустановлен. Это обстоятельство чрезвычайно важно учитывать при разработке условий культивирования иммобилизованных на инертном носителе клеток . В последнее время получено значительное число экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что образование и накопление алкалоидов в растениях это сложный, пространственно организованный динамический процесс. Большое внимание уделяется изучению влияния различных факторов среды не только на рост и развитие, но и на химический состав растительных организмов. Среди различных факторов интерес представляет геохимический фактор, так как установлена корреляция между содержанием в почве определенных химических элементов и продуцированием . Химический состав среды оказывает влияние на активность ферментов, принимающих участие в биогенезе действующих веществ растений, поэтому оптимальный синтез этих веществ связан с определенной концентрацией химических элементов в почве. Еще в году . I. Курсановым было отмечено, что активность ферментов растений зависит от состава зольных элементов . Известны также факты изменения не только количественного, но и качественного состава биологически активных веществ растений в зависимости от химического состава почвы . Микроэлементы оказывают активирующее или ингибирующее влияние на ферменты, катализирующие определенные стадии синтеза аминокислот. Например, тирозина и фенилаланина первичных предшественников изохолиновых алкалоидов. В связи с этим было проведено изучение влияния 0, ных водных растворов сульфатов кобальта и меди, активирующих биосинтез фенилаланина и тирозина, на биосинтез глауцина, а так же на прирост биомассы мачка желтого i v сем. Влияние кобальта на образование и накопление глауцина в растении в полевых условиях, повидимому, отсутствует. При внекорневой подкормке водным раствором сульфата меди наблюдалось повышение урожайности растения и положительное влияние на образование и накопление глауцина, а также вместе кобальта и меди на накопление в них глауцина при внекорневой подкормки . Установлено стимулирующее влияние марганца и меди на выход суммы алкалоидов в культуре ткани i i . Мурасиге и Скуга. При возрастании концентрации этих микроэлементов в 4 5 раз содержание аймалина в сумме алкалоидов увеличивалось более чем на . Проводили исследования по накоплению алкалоидов в каплусной культуре дурмана индейского Ixi i, в зависимости от увеличения в 2, 3, 4 и 5 раз дозировок марганца, меди и кобальта в питательной среде. В результате чего установили оптимальные концентрации микроэлементов для максимального выхода алкалоидов гиосциамина и скополамина. Эти концентрации в 3 4 раза выше, чем в среде по методу Мурасиге и Скуга. Такой эффект объясняется тем, что марганец и кобальт повышают активность фермента аргиназы, катализирующей превращение аргинина в орнитин, из которого синтезируется пиролидиновое кольцо тропановых алкалоидов. Положительное влияние меди на синтез алкалоидов объясняется образованием содержащих медь металлоферментов, которые являются катализаторами процессов переноса электронов от субстрата к кислороду при дыхании живых клеток. При внесении более высоких дозировок микроэлементов, содержание тропановых алкалоидов снижалось . Накопление алкалоидов сложный процесс, который в той или иной мере включает транспорт различных соединений. В связи с этим совершенно очевидно, что любое воздействие, в том числе и целенаправленное, затрагивающее транспорт алкалоидов, определенным образом может отразиться на их накоплении. Однако этот вопрос изучен совершенно недостаточно.