Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням

• Автор: Попадьин, Павел Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.23, 06.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 162 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.6.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Болезни и генетика устойчивости белокочанной капусты

1.1.1 Настоящая мучнистая роса.

1.1.2 Альтернариоз или чрная пятнистость

1.1.3 Кила.

1.2 Дефензины как представители антимикробных пептидов растении .

1.2.1 Антимикробная активность.

1.2.2 Механизм антимикробного действия.

1.2.3 Роль в защите растения.

1.3 Генная инженерия в селекции растений
1.3.1 Селекция растений в III тысячелетии
1.3.2 Проблемы применения генноинженерных подходов в селекции
растений
1.4 Регенерация из соматических клеток растений рода i.
1.5 Факторы, влияющие на агробактериальную трансформацию
представителей рода i.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1 Растительный материал.
2.2 Бактериальные штаммы и плазмиды.
2.3 Штаммы фитопатогенов
2.4 Культивирование i vi и генетическая трансформация белокочанной капусты
2.4.1 Введение в культуру i vi
2.4.2 Получение регенерантов методом прямого органогенеза
2.4.3 Стрессовая обработка эксплантов
2.4.4 Агробактериальная трансформация
2.4.5 Размножение растений клонированием i vi
2.4.6 Адаптация регенерантов к условиям i viv
2.5 ПЦРанализ наличия трансгена в геноме растений.
2.6 Гибридизация ДНК растенийрегенерантов по Саузерну
2.7 Анализ транскрипции трансгена методом реверсной ПЦР
2.8 Иммунофермептный анализ Вестернблоттинг трансформантов .
2.9 Оценка устойчивости трансгенных растений к заболеваниям
2.9.1 Оценка устойчивости растений поколения То к настоящей
мучнистой росе.
2.9.2 Оценка устойчивости растений поколения То к альтернариозу
2.9.3 Оценка устойчивости семенного потомства растений поколения Го к
2. Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Разработка методики регенерации белокочанной капусты.
3.1.1 Оценка растительного материала на интенсивность адвентивного
морфогенеза i vi.
3.1.2 Влияние состава питательных сред на адвентивный морфогенез в
условиях i vi
3.1.3 Влияние гипотермического стресса на адвентивный морфогенез в
условиях i vi
3.2 Разработка методики агробактермальной трансформации белокочанной капусты.
3.2.1 Анализ устойчивости растений белокочанной капусты к
канамицину.
3.2.2 Влияние генотипа растения, типа экспланта и штамма агробактерий
на эффективность генетической трансформации
3.3 Изучение трансгенных растений белокочанной капусты
3.3.1 Анализ растений поколения То на наличие транскриптов
трансгена
3.3.2 Анализ растений поколения То на содержаниепептида .
3.3.3 Первичная оценка устойчивости трансгенных растений поколения
То к настоящей мучнистой росе
3.3.4 Первичная оценка устойчивости трансгенных растений поколения
То к альтернариозу.1.
3.3.5 Первичная оценка устойчивости семенного потомства трансгенных
растений поколения То к киле.2.
3.3.6 Изучение наследования трансгена в семенном потомстве растений
поколения То.4.
3.3.7 Анализ на наличие транскрипции трансгена в семенном потомстве
растений поколения То6.
ВЫВОДЫ.1.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.4.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ
ЛИТЕРАТУРЫ.7.
ПРИЛОЖЕНИЕ.1.
ВВЕДЕНИЕ


Однако для борьбы с альтернариозом на продовольственной капусте фунгициды, разрешнные на территории Российской Федерации, отсутствуют. Поэтому более перспективным является выращивание устойчивых сортов. Тем не менее, в роде i не обнаружено источников устойчивости к патогену, вызывающему альтернариоз , . Группой бельгийских исследователей для борьбы с данным заболеванием на примере табака был предложен генноинженерный подход. Они получили трансгенные растения, экспрессирующие ген дефензина редьки 2, которые обладали высокой устойчивостью к альтернариозу . Таким образом, можно предположить, что генетическая трансформация с использованием этого гена позволит так же создать устойчивые к альтернариозу сорта белокочанной капусты. Кила крестоцветных, вызываемая облигатным грибным паразитом ii i VV. В странах северозападной Европы, России, Японии, Северной Америке и Австралии ею поражено более площадей, занятых крестоцветными культурами , . При сильном развитии килы потери урожая могут достигать Пересыпкин, . Патоген вызывает разрастание корней, а иногда и основания стебля в характерные опухоли, которые образуются в результате повышенного синтеза ауксинов в местах инфекции. Через несколько недель после разрастания, поражнные корни сгнивают, освобождая до в7 спор с одного растения Vi, . Жизненный цикл возбудителя килы состоит из двух фаз и достаточно полно описан у I и . Оптимальными условиями для развития заболевания являются температура почвы С и влажность . Основные источники инфекции растительные остатки и заражнная почва. Жизнеспособность зооспор . Пересыпкин, . В настоящее время наиболее общепринятой системой для расовой дифференциации возбудителя килы крестоцветных считается ЕСД Европейская система дифференциаторов, разработанная Букзаки i . ЕСДкомплект состоит из пятнадцати генотипов трх видов крестоцветных i i, В. В. . Номенклатура идентифицированных рас осуществляется с помощью ЕСДкода, который получают при сложении цифровых значений поражнных генотипов в каждой группе. Исходя из реакции ЕСДнабора сортовдифференциаторов, в различных регионах России были определены следующие расы Р. Москве и , Владимире , Татарии и , Перми , СергиевПосаде и СанктПетербурге , Екатеринбурге , Костроме Монахос и др. То есть на территории нашей страны популяция патогена представлена всеми известными в настоящее время генами вирулентности для В. Бороться с килой трудно. Агрохимические меры, такие как известкование почвы и внесение борных удобрений, ослабляют развитие болезни, но не предотвращают е, а высокоэффективных фунгицидов нет i . В связи с этим, на первый план в борьбе с данным заболеванием выходит селекция и возделывание устойчивых сортов. Монахос, . В противоположность ситуации с В. Монахос, Зубик, , у В. Опубликовано несколько классических генетических исследований устойчивости к киле у В. Их результаты объединены в табл. Из е данных следует, что устойчивость к киле у В. Это, на фоне двухлетнего цикла развития белокочанной капусты, значительно усложняет селекционный процесс. Ещ одним значительным затруднением является то, что в новом генетическом окружении устойчивый фенотип проявляется но всегда гак же эффективно, как в самом доноре устойчивости Ушанов, . Тем не менее, опубликованы результаты исследований, в которых удалось получить межвидовой гибрид между белокочанной капустой и рапсом сорта i 2, обладающим моногенной доминантной устойчивость к расе килы , а затем отобрать в потомстве Вз устойчивые растения. Авторы надеются создать с их помощью устойчивые к киле сорта i . Кроме того, на селекционной станции им. П. II. Тимофеева Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева уже созданы позднеспелые линии белокочанной капусты Ал и Хт , устойчивые к расе килы . Устойчивость у них контролируется комплементарным действием двух доминантных генов Монахос, . Однако при определнных условиях, например на очень кислых почвах или при концентрации зооспор . Вследствие этого возникает необходимость поиска альтернативных подходов к решению проблемы создания устойчивых к киле генотипов.