Разработка биотехнологических подходов получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов

• Автор: Сухосырова, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Структура и свойства коллагена

1.1.1. Коллаген и его типы

1.1.2. Аминокислотный состав коллагена

1.1.3. Спираль коллагена

1.1.4. Свойства коллагена

1.1.5. Характеристика некоторых типов коллагена

1.2. Методы определения коллагенолитической активности на природных и синтетических субстратах.
1.2.1. Природные субстраты
1.2.2. Синтетические субстраты
1.3. Выделение, характеристика и классификация экскретируемых коллагеназ у различных микроорганизмов.
1.3.1. Коллагеназы из ii ii и ii i
1.3.2. Коллагеназа из i и .
1.3.3. Коллагеназы из iii ii
1.3.4. Коллагеназы серинового типа выделенные из микроорганизмов
1.3.5. Коллагеназы из и i
1.4. Условия культивирования для направленной регуляции биосинтеза коллагенолитических ферментов микроорганизмами.
1.5. Условия хранения микроорганизмов продуцентов биологически активных веществ.
1.5.1. Хранение культур на агаризованных средах.
1.5.2. Хранение культур под слоем минерального масла.
1.5.3. Хранения культур на гранулах силикагеля
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследований
2.2. Поддержание культур дейтеромицетов на двух вариантах агаризованных сред
2.3. Методы хранения культур дейтеромицетов
2.3.1. Хранение культур дейтеромицетов на среде Чапека
2.3.2. Хранение культур дейтеромицетов под минеральным маслом на среде Чапека
2.3.3. Хранение дейтеромицетов под минеральным маслом
на среде с индуктором
2.3.4. Хранение на гранулах силикагеля в растворе глицерина
2.4. Культивирование дейтеромицетов в глубинных условиях
2.4.1. Метод выделения солерастворимой фракции коллагена
2.5. Определение коллагенолитической активности
2.5.1. Скрининг метод
2.5.2. Определение коллагенолитической активности в культуральной жидкости
2.5.2. а. Проведение ферментативного гидролиза и определение удельной коллагенолитической активности
2.5.2. б. Определение степени гидролиза коллагена
2.6. Методы выделения и очистки коллагенолитических ферментов
2.6.1. Осаждение этанолом
2.6.2. Гельфильтрация
2.6.3. Аффинная хроматография
2.7. Характеристика полученных ферментных препаратов
2.7.1. Электрофорез в ПААГ
2.7.2. Активность ферментных препаратов при различных значениях
2.7.3. Температурная устойчивость
2.7.4. Влияние ингибитора
2.7.5. Характеристика белковых фракций по аминокислотному составу
2.8. Определение белка по методу Лоури
2.9. Определение количества свободных х аминогрупп аминокислот нингидриновым методом
2 Определение сахаров антроновым методом
2 Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 3. ОТБОР МИКРООРГАНИЗМОВПРОДУЦЕНТОВ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
3.1. Определение коллагенолитической активности у различных видов дейтеромицетов
3.1.1. Поверхностное культивирование
3.1.2 Глубинное культивирование
3.2. Изучение стабильности некоторых видов
дейтеромицетов при различных условиях хранения.
3.2.1. Хранение на гранулах силикагеля
3.2.2. Хранение на среде Чапека под слоем
минерального масла
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ДЕЙТЕРОМИЦЕТАМИ
4.1. Оптимизация условий глубинного культивирования дейтеромицетов
4.2. Оптимизация условий определения коллагенолитической активности в культуральной жидкости при культивировании дейтеромицетов
4.3. Изучение возможности экзогенной регуляции секретирующей способности дейтеромицетов с использованием в качестве индуктора коллагена
4.4. Зависимость коллагенолитической активности от
числа пассажей
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ А.Р1АУи8.
5.1. Разработка методов выделения и очистки коллагенолитических ферментов из культуральной жидкости
5.2. Изучение физикохимических свойств полученных ферментных препаратов
ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Аауиэ позволяет получать электрофоретически гомогенные энзимные препараты, относящиеся к разряду нейтральных, термолабильных металлопротеиназ. Совокупность предложенных биотехнологических подходов, включающих отбор штаммов продуцентов, оптимизацию условий хранения и культивирования, методы выделения и очистки энзимов, может служить основой для создания лабораторного, а в последующем, опытнопромышленного регламентов получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов. Научная новизна. В работе впервые предложен комплекс критериев, позволяющих провести отбор перспективных штаммов продуцентов коллагенолитических ферментов. Оптимизирован состав питательной среды для глубинного культивирования дейтеромицетов, обеспечивающий синтез ими коллагенолитических ферментов. Показан индуцибельный характер синтеза коллагенолитических ферментов для трех культур микромицетов А. Аауиэ, Р. Игуэодепит и Р. Для А. Аауиэ впервые выявлены оптимальные параметры консервации и условия хранения посевного материала на среде с индуктором для поддержания коллагенолитической активности ферментов на высоком уровне. А.Аауиэ. Впервые охарактеризованы некоторые физикохимические свойства полученных энзимов оптимум , температурная чувствительность, молекулярная масса, влияние ингибиторов, аминокислотный состав. Практическая значимость. Разработанные биотехнологические подходы позволили определить параметры, на основе которых может быть создана универсальная технология получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов. Проведенные исследования дали возможность осуществить отбор перспективных штаммов дейтеромицетов из музея культур НИЦ БМТ, синтезирующих коллагенолитические ферменты. Показан индуцибельный характер секреции коллагенолитических ферментов микромицетами, на основании чего предложен состав питательной среды при подготовке посевного материала и условия глубинного культивирования. Разработаны методы выделения и очистки энзимов из культуральной жидкости А. Аауиэ до гомогенного состояния, что создат предпосылки для получения на их основе новых лекарственных препаратов. ГЛАВА 1. Структура и свойства коллагена Группа коллагенолитических ферментов уникальна по своей способности при определенных условиях специфически гидролизовать спиральную область нативной молекулы коллагена, крайне устойчивой к действию других протеаз . Критерии, позволяющие отнести какойлибо белок к группе коллагена следующие специфичность аминокислотного состава, уникальное пространственное расположение полипептидных цепей, которое регистрируется рентгеноструктурным анализом при съемке под большими углами и характерная поперечная исчерченность волокнистых структур, обнаруживаемая с помощью электронного микроскопа и рентгенографии при съемке под малыми углами ,, . Коллаген является компонентом внеклеточного матрикса соединительных тканей млекопитающих сухожилие, хрящи, ткани костей, зубов и т. Он различается по структуре и свойствам в зависимости от вида соединительной ткани, а также от возраста животного. К началу х годов было выделено и достаточно хорошо изучено 5 типов коллагена, различающегося по первичной структуре, содержанию связанных углеводов, степени межмолекулярных связей и другим свойствам , . Позднее удалось расширить рамки изученного и классифицировать коллаген уже на типов , . Как правило, в коллагеновых белках почти не содержатся цистеин и триптофан. Количественное содержание оксипролина является показателем сохранности структуры нативного коллагена в тканях и степени его чистоты. Макромолекулы коллагена I типа, имеющие трехцепочечное строение состоят из двух видов спиральных полипептидных цепей, а именно двух идентичных Х1 цепей и одной цепи, значительно отличающихся по составу аминокислот и химическому строению и цепи 3, 5. Белковые цепи сх , , х1 III отличаются друг от друга аминокислотным составом, молекулярной массой и другими физикохимическими свойствами . Таблица 1. Аминокислотный состав различных коллагенов тканей человека н позвоночных животных . Серии . Метионин 7,0 5,7 5,8 6,3 6,6 5. Гистидин 5,4 5,4 5,4 5,1 4,6 4. Оксилизин 5,9 8. Число остатков на .