Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК

• Автор: Ванюшева, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

1.1. Роль точечных мутаций в патогенезе различных заболеваний человека

1.1.1. Мутации в генах факторов II, V свертываемости крови, метилентетрагидрофолатредуктазы человека и их связь с предрасположенностью к тромбозам и гипергомоцистеинемии.
1.1.2. Мутации в гене ангиотензиногена человека и их связь с предрасположенностью к первичной гипертонии и преэклампсии.

1.1.3. Мутации в генах рецептора витамина , а1коллагсна типа 1, эстрогенового

рецептора а человека и их связь с предрасположенностью к остеопорозу.

1.2. Современные методы детекции точечных мутаций

1.2.1. Метод детекции точечных мутаций, основанный на удлинении праймера на

один нуклеотид.

1.2.1.1. Анализ точечных мутаций с помощью капиллярного электрофореза

1.2.1.2. Анализ точечных мутаций с помощью флуоресцентной поляризации

1.2.1.3. Анализ точечных мутаций с помощью массспектрометрии

1.2.2. Метод детекции точечных мутаций на основе полимеразной цепной реакции
с детекцией в режиме реального времени.
1.2.3. Метод детекции точечных мутаций на основе аллельспецифического олиго
нуклеотидного лигирования
1.2.4. Метод детекции точечных мутаций на основе аллельспсцифической гибридизации олигонуклеотидов.
1.2.5. Методы детекции точечных мутаций, основанные на анализе конформацион
Ф ного полиморфизма ДНК.
1.2.5.1. Гетеродуплексный анализ.
1.2.5.2. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов
1.2.6. Методы детекции точечных мутаций, основанные на использовании эндонуклеаз
1.2.6.1. Аллельспецифический анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции.
1.2.6.2. Анализ с использованием эндонуклеаз, специфичных к нсспаренным нуклеотидам в ДНК
1.2.7. Метод детекции точечных мутаций на основе аллельспецифичсской полимеразной цепной реакции.
1.3. Практическая реализация технологии детекции точечных мутаций
1.3.1. Наборы реагентов, основанные на удлинении праймера на один нуклеотид
1.3.2. Наборы реагентов, основанные на полимеразной цепной реакции с детекцией
в режиме реального времени
1.3.3. Наборы реагентов, основанные на использовании аллельспецифичсской гибридизации олигонуклеотидов
1.3.4. Наборы реагентов, основанные на использовании эндонуклеаз и ферментов репарации
1.3.5. Наборы реагентов, основанные на аллельспсцифической полимеразной цепной реакции.
ГЛАВА 2. Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллельспецифической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК. Обсуждение результатов.
2.1. Разработка методологии конструирования аллельспсцифических праймеров
для АСГ1ЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом.
2.2. Создание системы детекции мутаций в генах факторов II А, V 1 А свертываемости крови и метилентетрагидрофола гредуктазы С7Т человека методом АСГТЦР
2.2.1. Идентификация генотипов методом секвенирования.
2.2.2. Дизайн праймеров и оптимизация условий АСПЦР
2.2.3. Клонирование фрагментов геномной ДНК человека, содержащих области с предполагаемыми мутациями в генах факторов II 1ОА, V в А свертываемости крови и метилентетрагидрофолатредуктазы С7Т
2.3. Создание системы детекции полиморфизмов М5Т, Т4М и А в гене ангиотензиногена человека методом АСПЦР
2.3.1. Идентификация генотипов методом секвенирования.
2.3.2. Дизайн праймеров и оптимизация условий АСПЦР
2.4. Создание системы детекции нуклеотидных замен в генах а1коллагена типа I ОТ, рецептора витамина О2А и эстрогенового рецептора а человека Т8С и А методом АСПЦР.
2.4.1. Идентификация генотипов методом секвенирования.
2.4.2. Идентификация полиморфизма С2А в гене рецептора витамина с помощью эндонуклеазы рестрикции Взт I.
2.4.3. Дизайн праймеров и оптимизация условий АСПЦР
2.5. Анализ продуктов АСПЦР с помощью автоматических анализаторов ДНК с
флуоресцентной дегекцией
2.5.1. Флуоресцентные красители, используемые для мечения ДНК.
2.5.2. Известные системы для автоматического анализа ДНК с использованием флуоресцентной детекции приборы и используемые флуорофоры.
ф 2.5.3. Анализ мутаций в генах ангиотензиногена, факторов II и V свертываемости
крови, метилснтстрагидрофолатредуктазы, рецепторов витамина и эстроге
нового а, а также а 1 коллагена типа I человека
2.6. Влияние способов выделения геномной ДНК на точность идентификации мутаций ПО
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть
3.1. Реактивы и материалы.
3.2. Приборы и методы.
3.3. Общие методики.
3.3.1. Выделение ДНК с использованием протеиназы К и фенольной экстракции
3.3.2. Выделение ДНК с использованием набора реагентов АЦя ОЫА Ргер фирмы Биоком
3.3.3. Выделение ДНК с использованием набора реактивов фирмы Мсдиген
3.3.4. Выделение ДНК с использованием сорбента СНе1ех 0.
3.3.5. Аллсльспсцифическая полимеразная цепная реакция.
3.3.6. Электрофорез в агарозном геле
3.3.7. Электрофорез в полиакриламидном геле.
3.3.8. Капиллярный электрофорез.
3.3.9. Секвенирование ПЦРфрагментов с использованием Рмечсных праймеров поСэнгеру.
3.3 Ссквснированис ПЦРфрагментов с использованием Су5мечсных терминаторов но Сэнгсру
3.3 Приготовление стандартов длины
3.3 Проведение ферментативных реакций.
ф 3.3 Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК.
3.3 Трансформация клеток . i и анализ клонов
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ДИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АРС активированная форма белка С
АСПЦР аллельспецифичсская полимеразная цепная реакция
ДСН дуплексспецифическая нуклеаза
КЭ капиллярный электрофорез
мпкт минеральная плотность кости
МТГФР м ети л с нтетраг и д рофо л атреду ктаза
пл. нуклеотидная пара
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
РАС ренинангиотензиновая система
ангиотензиноген
I1 аколлаген типа
I иммуноферментный анализ
эстрогеновый рецептор а
резонансный перенос энергии флуоресценции
полиморфизм длин фрагментов рестрикции
конформационный полиморфизм одноцепочечных фрагментов ДНК.
Для обозначения аминокислотных остатков, нуклеотидов, олиго и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии I и Международного союза биохимиков .
ВВЕДЕНИЕ


Система свертывания крови представляет собой каскад протеолитических реакций, в результате которых целый ряд прокоагулирующих белков переходит в активную форму, и в конечном итоге происходит образование фибринового сгустка тромба. Сдерживает тромбообразование активированная форма белка С Кзависимой сериновой протсиназой, которая проявляет свою ингибирующую тромбообразование функцию путем протеолитического расщепления прокоагулирующих белков факторов V и VIII системы свертываемости крови. Устойчивость этих факторов к АРС в результате присутствия мутаций в их генах лежит в основе генетической предрасположенности к тромбозам 1, 2. Причиной наиболее распространенной устойчивости к АРС является точечная мутация А в факторе V свертываемости крови, которая вызывает замену 6й аминокислоты аргинина на глутамин 1 рис. В норме фактор V инактивируется за счет расщепления пептидной связи, расположенной с СООНконца от аргинина 6, за которым следует гидролиз пептидной связи, расположенной рядом с аргинином 6. Мугантная форма фактора V устойчива к гидролизу по аргинину 6. Рнс. Точечная мутация в гене фактора V свертываемости крови, выражающаяся в замещении на А, приводит к тому, что в участке протеолиза активированной формой белка С происходит замена аминокислоты аргинина на глутамин. Таким образом, мутация i фактора V определяет феномен устойчивости к антикоагуляторному действию АРС. Данная мутация всгречается с частотой среди европейского населения 3. Среди пациентов с венозными тромбозами се частота увеличивается до 4, в случае венозных тромбозов и тромбоэмболий, имеющих место во время беременности, частота ее варьируется от ,7 5 до 3. Известна также связь данного полиморфизма с предрасположенностью к тяжелому осложнению беременности преэклампсии 6, а также к инфаркту миокарда 7. В последнем случае частота встречаемости мутации i возрастает до ,8 . Протромбин является предшественником сериновой протеиназы тромбина, который является ключевым ферментом процесса гемостаза и тромбообразования. Он обладает прокоагулянтной, антикоагулянтной и аптифибринолитической активностями 8. Мутация 0 в Знетранслируемой области гена протромбина встречается у популяции 6, 8 и ассоциирована с увеличением концентрации прогромбина в плазме. Механизм такой зависимости пока не ясен, но способствует повышенному образованию тромбина и ухудшает инактивацию фактора V с помощью 9. Наличие данной мутации является одним из главных факторов риска для предрасположенности к образованию венозных тромбозов , венозных тромбоэмболий . Среди пациенгов с венозными тромбозами ее частота увеличивается до , при этом, в случае венозных тромбозов встречается также и мутация i 8. В случае тромбозов, имеющих место во время беременности, частота ее варьируется от 9,3 3 до ,9 5. Одновременно мутации фактора V i и 0 встречаются у 9,3 беременных женщин, страдающих тромбозами и такое сочетание мутаций отсутствует в группе женщин с нормальным течением беременности 5. Метилентетрагидрофолатредуктаза МТГФР катазизирует в организме человека восстановление 5,мстилентетрагидрофолата до 5метилтетрагидрофолата и играет ключевую роль в синтезе метионина из гомоцистсина Хотя в сыворотке и других тканевых жидкостях обнаруживаются разные формы фолатов, главной формой фолата в плазме является 5мстилтетрагидрофолат, несущий на себе метильную группу, необходимую для превращения гомоцистеина в метионин. Наличие мутации С7Т в гене метилентетрагидрофолатредуктазы приводит к замене аминокислотного остатка аланина на остаток валина в сайте связывания фолата, что приводит к снижению активности фермента и его термолабильности активность фермента при С и выше существенно снижается. В результате снижения активности фермента метилентетрагидрофолат не может восстанавливаться до метилтетрагидрофолата, что приводит к неспособности образования метионина из гомоцистеина и, следовательно, к истощению запаса метионина и выбросу в кровь избытка гомоцистеина . Избыток гомоцистеина в крови проводит к гипсргомоцистеинемии во время беременности или при снижении активности МТГФР до и ниже 4, , а также увеличивает риск возникновения тромбоза во время беременности 3.