Эмбриоинженерные аспекты повышения эффективности технологии получения трансгенных животных

• Автор: Попова, Елена Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Боровск
• Количество страниц: 107 с.

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Современное состояние и перспективы развития технологии получения трансгенных животных.

1.2. Методы введения чужеродных генов в геном животных.

1.3. Основные факторы, влияющие на эффективность технологии получения траисгснных животных.
1.4. Использование РСЯанализа для определения интеграции трансгена на стадии эмбриона.

2. Собственные исследования

2.1. Материал и методы исследований.

2.1.1. Получение эмбрионов мышей.

2.1.2. Микроинъекция различных веществ в пронуклеус и цитоплазму зигот.

2.1.3. Кратковременная инкубация и культивирование зародышей в питательных средах.

2.1.4. Трансплантация эмбрионов псевдобеременным самкамреципиентам.
2.1.5. Определение интеграции трансгена с помощью РСКанализа на стадии эмбриона и у потомства мышей, полученного из зигот, микроинъецированных генноинженерной конструкцией.
3. Результаты исследований.
3.1. Изучение влияния непродолжительной инкубации мышиных зигот в различных манипуляционных средах на их дальнейшее развитие и приживляемость в организме самокреципиентов.
3.2. Исследование влияния генноинженерных конструкций, используемых для микроинъекции, на развитие мышиных зигот i vi.
3.3. Изучение влияния механического повреждения цитоплазматической мембраны и оболочки пронуклеуса мышиных зигот на их развитие i vi.
3.4. Исследование влияния различных растворов, используемых для разведения генноинженерных конструкций при микроинъекции, на развитие мышиных зигот i vi.
3.5. Влияние концентрации генноинженерной конструкции на развитие мышиных зигот i vi, их приживляемость и частоту интеграции трансгена.
3.6. Интеграция генноинженерной конструкции в геном эмбрионов и потомства мышей в зависимости от стадии клеточного цикла зиготы.
3.7. Изучение факторов, влияющих на приживляемость микроинъецированных зародышей.
3.7.1. Влияние промежуточного культивирования микроинъецированных зародышей на их приживляемость в организме самокреципиентов.
3.7.2. Зависимость приживляемости эмбрионов и беременности самокреципиентов от количества трансплантированных зародышей.
Обсуждение
Практические предложения Список литерату ры
Введение


Результатом такого рода воздействий может быть снижение жизнеспособности зародышей и их последующая гибель, что значительно снижает общую эффективность технологии получения трансгенных животных. Наряду с пониженной жизнеспособностью эмбрионов, одной из основных проблем технологии трансгеноза является низкая частота интеграции генноинженерных конструкций в геном хозяина, механизм которой до настоящего времени остается недостаточно изученным i i . Повышение интеграции трансгена в геном эмбрионов и полученного потомства позволило бы значительно увеличить выход трансгенных животных и общую эффективность технологии трансгеноза. В связи с тем, что основные этапы технологии трансгеноза базируются на общебиологических принципах, совершенствование технологии трансгеноза чаще всего проводится на лабораторных животных. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы было изучение влияния некоторых эмбриоинженерных факторов на эффективность технологии трансгеноза. Изучить влияние непродолжительной инкубации мышиных зигот в различных манипуляционных средах на их дальнейшее развитие i vi и приживляемость в организме самокрециписнтов. Исследовать влияние генноинженерных конструкций, используемых для микроинъекции, на развитие мышиных зигот i vi. Выяснить влияние механического повреждения цитоплазматической мембраны и оболочки пронуклеуса зигот на их развитие i vi. Исследовать влияние различных буферных растворов, используемых для разведения генноинженерных конструкций, на жизнеспособность микроиньецированных мышиных зигот i vi. Уточнить влияние концентрации генноинженерной конструкции, вводимой в пронуклеус, на выживаемость зародышей и частоту интеграции трансгепа в экспериментах i vi и i viv. Исследовать зависимость между частотой интеграции и фазой клеточного цикла зиготы, во время которой проводилась инъекция генноинженерной конструкции в опытах i vi и i viv. Изучить влияние промежуточного культивирования микроинъецированных эмбрионов i vi на их приживляемость в организме самокреципиентов. Изучить зависимость между числом трансплантированных микроинъецированных эмбрионов и их приживляемостью в организме самокреципиентов. Научная новизна работы. Впервые получены трансгенные мыши, с интегрированной в геном генноинженерной конструкцией, содержащей нуклеотидные последовательности гена человеческого гранулоцитколониестимулирующего фактора под промотором казеина крупного рогатого скота . Впервые изучена зависимость между фазой клеточного цикла зигот, на которой в пронуклсус вводится генноинженерная конструкция, и интеграцией трансгена в геном эмбрионов доимплантационных стадий развития и родившегося из микроинъецированных зигот потомства. Выявлена зависимость выживаемости зародышей в условиях i vi от концентрации генноинженерной конструкции размер 3,5 т. Определены оптимальные условия трансплантации мышиных эмбрионов, при которых достигается наибольшая эффективность получения потомства из зигот, микроинъецированных генноинженерной конструкцией. Показано, что кратковременная инкубация мышиных зигот в растворе Дюльбекко или среде М2, обогащенных 0,3 БСА, не оказывает отрицательного влияния на их дальнейшее развитие i vi и приживляемость в организме самокреципиентов. Положения, выносимые на защиту. Микроинъекция генноинженерной конструкции в пронуклеусы зигот, находящихся на стадии в1 клеточного цикла, способствует несколько большей частоте интеграции трансгена в геном эмбрионов и потомства, полученного из микроинъецированных зигот. Генноинженерная конструкция аСп0С8Б, разведенная в ТЕбуфере, может быть использована в работе по получению трансгенных лабораторных и сельскохозяйственных животных в концентрации от 5,0 до ,0 нгмкл без существенного снижения жизнеспособности эмбрионов и частоты интеграции трансгсна. Основными факторами, влияющими на жизнеспособность микроинъецированных зигот млекопитающих, является прокол пронуклеуса и генноинженерная конструкция, введенная в пронуклеус. Трансплантация мышамреципиентам первого дня псевдобеременности от до зигот, инъецированных генноинженерными конструкциями, позволяет увеличить процент беременности самокреципиентов и приживляемость зародышей.