Поляризационный флуороиммуноанализ физиологически активных веществ

• Автор: Еремин, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.23, 02.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 270 с. : ил.

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цель и задачи исследования

Глава 2 Применение метода ПФИА для анализа физиологически активных веществ Литературный обзор

2.1. Принципы поляризации флуоресценции

2.2. Основы поляризациошгого флуороиммуноанализа

2.3. Достоинства, ограничения и пути развития ПФИА

2.4. Техника эксперимента

Резюме к главе 2

Глава 3 Особенности получения иммунореагентов и определения наркотиков методом ПФИА

3.1. Синтез иммуногенов и флуоресцеинмеченных трейсеров для определения метамфетамина
3.2. Влияние гетсрологичности структуры флуоресцсинмеченного трейсера на чувствительность определения метамфетамина
3.3. Влияние длины мостика в трейсерах на константу аффинности и чувствительность определения метамфетамина методом ПФИА
3.4. Разработка определения бензфстамина и метамфетамина
3.5. Стратегия получения иммунорсагентов для определения наркотиков группы фенилалкиламинов
3.6. Особенности определения эфедрина и фенилпропаноламина методом ПФИА
3.7. Оптимизация методик и корреляция результатов ПФИА с данными других методов определения фенилалкиламинов
3.8. Определение опиатов и бензодиазепинов методом ПФИА
Резюме к главе 3
Глава 4 Получение иммунореагентов и оптимизация условий определения лекарств и гормонов методом ПФИА
4.1. Определение фенобарбитала и барбамила как наркотических веществ
4.2. Влияние структуры иммуногена и флуоресцентных трейсеров на специфичность и чувствительность определения фенобарбитала в сыворотке крови
4.3. Разработка методов ПФИА для определения антибиотиков хлорамфеникола, беизилпенициллина, гентамицина, канамицина и стрептомицина
4.4. Сравнение определения антибиотика гентамицина методами ФИА с детекцией поляризации и интенсивности тушения флуоресценции
4.5. Оптимизация методов ПФИА для определения сульфаметазина, сулъфадиазина и других сульфаниламидных препаратов
4.6. Экспрессное определение котинина, являющегося основным метаболитом никотина, и дискриминация курильщиков
4.7. Выбор иммуногенов для получения специфических антител и разработки метода ПФИА для определения прогестерона и оксипрогестерона
Резюме к главе
Глава 5 Экспрессное определение хлорсодержащих пестицидов методом ПФИА
5.1. Разработка методов ПФИА на хлорсодержащие гербициды класса феноксикислот
5.2. Выбор трейсеров для повышения чувствительности ПФИА на примере определения гербицидов 2,4Д и 2,4,5Т
5.3. Оптимизация ПФИА для специфического индивидуального определения хлорсодержащих пестицидов
5.4. Особенности выбора иммунореагентов постановки ПФИА на индивидуальный пестицид и на группу близких по структуре пестицидов класса хлорфеноксикислот 2М,4Х и 2М,4ХМ
5.5 Разработка специфического и классспсцифического
методов ПФИА для определения ДДТ Резюме к главе 5
Глава 6 Экспрессное определение соединений класса триазинов
6.1. Влияние структуры иммунореагентов на предел обнаружения метода ПФИА для определения гербицидов группы триазинов
6.2 Влияние структуры бокового радикала трейсера на
чувствительность определения атразина методом ПФИА
6.3. Однореагсптный метод ПФИА для определения атразина
Резюме к главе 6
Глава 7 Экспрессное определение гербицидов методом ПФИА
7.1. Разработка иммунореагентов на хлорацетанилидные гербициды
7.2. Определение гербицидов семейства сулъфонилмочевины методом ПФИА
7.3. Разработка метода ПФИА для определения гербицидов класса арилмочевины метабензтиазурона и изопротурона
7.4. Разработка метода ПФИА для определения гербицида пропанида Резюме к главе
2
Глава 8 Получение иммунореагентов для определения
ксенобиотиков загрязнителей воды и пищевых продуктов
8.1. Выбор стратегии для получепия антител на нонилфенол и оптимизация метода ПФИА
8.2. Разработка метода ПФИА для экспрессного определения линейных алкилсульфонатов ЛАС
8.3. Оптимизация метода ПФИА для определения охратоксина
8.4. Разработка метода ПФИА для определения инсектицида паратионметила
Резюме к главе
Г лава 9 Современное состояние и перспективы развития
определения физиологически активных веществ методом ПФИА
9.1. Проведение ПФИА в системе обращенных мицелл
9.2. Определение пестицидов методом ПФИА в системе
остановленной струи потока
9.3. Применение метода поляризации флуоресценции для определения ферментов
9.4. Пути развития других иммунофлуоресцентных методов
9.5. Общие закономерности по выбору иммунореагентов и разработке методов ПФИА физиологически активных веществ
Список физиологически активных веществ, для
определения которых были разработаны методики ПФИА Выводы
Список литературы


Концентрацию трейсеров рассчитывали по оптической плотности раствора трейсера в мМ карбонатном буфере 9,0 при длине волны 2 нм, допуская, что коэффициент экстинкции для трейсеров такой же, как для флуоресцеина и равен 8, 1 МГ см1. Рабочий раствор трейсера готовили в боратном буфере, интенсивность которого соответствовала 0кратному значению интенсивности флуоресценции фонового раствора боратного буфера. Измерение поляризации флуоресценции проводили на поляризационных флуориметрах фирмы i Англия, фирмы V США, xанализатор фирмы США, АФП2 производства ВНИИБП Россия и другие. В качестве кювет для измерений использовали специальные боросиликатные стеклянные пробирки или кварцевые кюветы. В качестве контроля неспецифического связывания тестировали антисыворотку иеиммунизированного животного. Р, и по этому графику определяли разведение антител, вызывающее ное связывание трейсера титр. Рис 2 4 3 Типичный график титрования антител методом поляризации флуоресценции
Для получения градуировочных графиков в измерительную пробирку вносили образец, раствор трейсера и раствор антител в оптимальном разведении или концентрации. Проводили измерение поляризации флуоресценции в соответствии с программами приборов. На основании параллельных результатов измерения растворов со стандартными концентрациями вещества строили градуировочный график зависимость величины поляризации флуоресценции тР от концентрации стандартных растворов вещества логарифмическая шкала. X
в
о
г
i

0


0,
0. Рис 2 4 4. Поляризацию флуоресценции измеряли на приборах в ручном и автоматическом режимах. В зависимости от прибора, время измерения аналитического сигнала одного образца составляло с. При измерении на приборе ТДх в полуавтоматическом режиме предусмотрено ручное дозирование иммунореагентов в пробирки и автоматическое измерение по программе . Общее время измерения образцов около 7 мин. Полностью автоматический анализ на ТДханализаторе проводили следующим образом. Не менее мкл стандартных растворов или образцов переносили в специальные катриджи прибора, которые вместе с пробирками помещали в специальную карусель. В специальный пакетреагентов помещали три флакона, содержащих раствор антител определенного разведения, раствор грейсера определенной концентрации и раствор фосфатного буфера для разбавления. В специально отведенные места прибора устанавливали пакетреагентов, карусель и бутыль с буфером для разбавления. Общее время всего определения составляет мин в зависимости от используемой программы для измерения образцов. Для построения градуировочной кривой использовали 6 калибраторов стандартных растворов анализируемого вещества с различными концентрациями определяемого вещества, приготовленных на буфере или на воде. Для каждого протокола проведения анализа на приборе ТДх в автоматического режиме подбирались условия, которые удовлетворяли критериям качества градуировочного графика, заложенного в память прибора. При выборе условий ПФИА на приборе ТДх в автоматическом режиме необходимо было выполнить следующие требования к анализу 1 наличие определенного перепада поляризации флуоресценции между калибраторами между нулевым и первым калибратором, между соседними калибраторами, между наибольшим и наименьшим калибраторами 2 значение поляризации флуоресценции нулевого калибратора должно находиться в определенных пределах от 0 до 0 ед. Данные требования обоснованы исходя из методик ПФИА для наборовреагентов фирмы АЬЬоН для мониторинга лекарственных веществ, которые были приняты нами за образец. Расчет аналитических характеристик метода ПФИА
При представлении градуировочных зависимостей поляризации флуоресценции от концентрации аналита использовали десятичные логарифмы концентраций аналита тРйС. РшР0 ВВо от логарифма концентрации аналита. Типичная градуировочная кривая определения веществ методом ПФИА имеет сигмообразный вид, как и все градуировочные графики для иммунохимических методов анализа низкомолекулярных веществ 9. АП1. Ь наклон кривой в точке 1С, С концентрация ГС, при которой связывание стрейсером составляет , О минимальноезначение сигнала поляризации флуоресценции.