Иммуноаналитические методы определения тироксина на основе моноклональных антител

• Автор: Мертц, Марианна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1996
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение.

Глава1. Литературный обзор.

1.1. Строение и функции щитовидной железы

1.2. Заболевания щитовидной железы, их диагностика и лечение И

1.3. Иммуноанализ тироксина

1.3.1. Особенности получения антител к тироксину

1.3.2. Получение моноклональных антител к тироксину.

1.3.3. Методы иммуноанализа тироксина

1.3.3.1. Радиоиммуноанализ.

1.3.3.2. Иммуноферментный анализ

1.3.3.3. Использование гетерологичных конъюгатов гаптенов в иммуноферментном анализе
1.3.3.4. Флуоресцентный и хемилюминисцентный иммуноанализ.
1.3.3.5. Метод с применением липосом.
1.3.3.6. Нефелометрический и гурбодиметрический анализ
1.3.4. Способы получения стандартных растворов тироксина
1.4. Тенденции развития иммуноаналитических методов в медицинской диагностике.
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Материалы
2.2. Получение конъюгированных антигенов
2.2.1. Получение конъюгата тироксинБСА с использованием карбодиимида в качестве сшивающего агента
2.2.2. Получение конъюгата трийодтиронинБСА
2.3. Антитела.
2.3.1. Определение титра антител в твердофазном ИФА.
2.3.2. Выделение моноклональных антител ионообменной хроматографией
2.3.3. Характеристика антител
2.3.3.1. Определение константы связывания антител методом твердофазного ИФА.
2.3.3.2. Определение подкласса антител
2.3.3.3. Определение специфичности антител методом твердофазного ИФА.
2.3.3.4. Электрофорез.
2.3.5. Приготовление сефарозы с иммобилизованными
антитироксиновыми антителами.
2.4. Реагенты для иммуноанализа
2.4.1. Стандартные растворы тироксина в сыворотке
2.4.2. Конъюгирование антител с ферментом
2.4.3. Конъюгирование тироксина с пероксидазой из хрена
2.4.4. Иммобилизация реагентов на твердофазные носители
2.5. Методы иммуноанализа общего тироксина.
2.5.1. Твердофазный иммунометрический анализ тироксина.
2.5.2. Прямой твердофазный иммуноферментный анализ тироксина.
2.6. Определение оптимального времени анализа
2.7. Определение рабочей концентрации АН С.
2.7.1. Зависимость связывания антител к тироксину от концентрации АН С.
2.7.2. Зависимость ингибирования от концентрации АНС
2.8. Определение характеристик методов.
2.8.1. Определение параметров калибровочной кривой
2.8.2. Линейность разведения пробы.
2.8.3. Вариабельность
2.8.4. Чувствительность
2.8.5. Тест на открытие
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Характеристика антител
3.2. Определение концентрации общего тироксина
методом прямой I.
3.3. Методы измерения тироксина, основанные на
непрямой I.
3.4. Оптимизация параметров иммунометрического
анализа общего тироксина.
3.4.1. Сорбция конъюгатов гормонбелок на пластик
3.4.2. Влияние АНС на результаты анализа.
3.4.3. Очистка сыворотки.
3.4.4. Характеристики анализа общего тироксина.
3.4.5. Условия хранения реагентов
Список сокращений, использованных в работе.
Список литературы


Очевидно, что рост этих заболеваний не в последнюю очередь связан с ухудшением экологических условий. Для полной оценки тироидного статуса необходимо учесть концентрацию всех гормонов, связывающих белков, аутоантител и других факторов, участвующих в регуляции работы щитовидной железы И, . Для первичной оценки достаточно знать концентрации в крови тироксина и тиротропина , , . В настоящее время для измерения концентрации тироксина применяют в основном иммуноаналитические методы. Антитела должны обладать высокой специфичностью и аффинностью к тироксину, поэтому использование моноклональных антител намного предпочтительней, чем использование поликлональных , . Кроме того, явные преимущества имеют методы, применимые для проведения массовых анализов в клинике они не должны . Целью данной работы является создание количественных нммуноферментных методов определения тироксина с использованием моноклональных антител. Моноклональные антитела к тироксину были получены ранее в лаборатории молекулярной биотехнологии АО Биотехнология. Научная новизна. Изучены возможности использования моноклональных антител к тироксину 1В7 в твердофазных методах определения тироксина, основанных на принципе прямой и непрямой I. Разработан иммунометрический метод определения общего тироксина в сыворотке крови на основе моноклональных антител. Изучено влияние гетерологии на чувствительность и специфичность иммунометрического метода. Практическая значимость работы. Тема диссертационной работы является темой, утвержденной и финансировавшейся Министерством Здравоохранения и Министерством по Чрезвычайным Ситуациям Т4ТЕСТ. В данной работе создана тестсистема для количественного определения концентрации тироксина в сыворотке крови на основе моноклональных антител, которая позволяет провести анализ за минут, использовать малый объем крови достаточно брать кровь у больных из пальца, проста в исполнении. Разработанный метод по своим характеристикам не уступает лучшим зарубежным аналогам, являясь при этом более экономически выгодным. Мегод опробован на банке сывороток штук, любезно предоставленном Институтом Экспериментальной Эндокринологии Эндокринологического Научного Центра РАМН. Глава. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. Щитовидная железа расположена на передней поверхности трахеи, между щитовидным хрящем и трахейными кольцами. Это единственный орган организма, способный синтезировать вещества, содержащие йод. Щитовидная железа секретируст два характерных гормона тироксин и трийодтиронин, являющихся производными тирозина. Синтез тироидных гормонов происходит в фолликулах, имеющих диаметр 0 мкм. Полость фолликул заполнена коллоидом, состоящим в основном из тироглобулина гликопротеида с мол. Почти весь новообразованный тироксин и трийодтиронин сохраняют связь с тироглобулином в тироидных пузырьках до тех пор, пока они не поступят в кровь, высвободившись под действием протеолитических ферментов. Включение иода в щитовидную железу. На этой стадии йод поступает в организм с пищей, всасывается кишечником и затем с током крови поступает в щитовидную железу, которая захватывает и концентрирует йод со скоростью около 2 мкг в час. Захват йода из плазмы и транспорт через мембрану осуществляется с помощью АТФазы. Электронномикроскопические исследования показали, что уже через секунд после введения в организм радиоактивного йода наблюдается его накопление в фолликулах. Органификация йода. МИТ и ДИТ. Процесс конденсации. Этот процесс заключается в образовании трийодтиронина ТЗ и тироксина Т4 из молекул МИТ и ДИТ. Специфические ферменты, участвующие в образовании ТЗ и Т4 пока не идентифицированы, однако известно, что псроксидаза не участвует в этой стадии образования гормонов. Высвобождение гормонов щитовидной железы. Йодтиронины освобождаются из тиреоглобулина в результате протеолиза, который осуществляется внутриклеточными протеиназами эпителиальных клеток. В норме у человека ежедневная секреция гормонов составляет примерно мкг тироксина и около мкг трииодотиронина 1, 3.