Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак

• Автор: Рахманин, Петр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Щёлково
• Количество страниц: 105 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. БЕШЕНСТВО ЖИВОТНЫХ

1.1.1. Эпизоотическая обстановка по бешенству в РФ.

1.1.2. Эпидемиологическая ситуация бешенства гидрофобии в Российской Федерации.2.

1.2. .ВОЗБУДИТЕЛЬ БЕШЕНСТВА

1.2.1. Характеристика возбудителя

1.2.2. Морфология и химический состав

1.2.3. Устойчивость вируса.

1.2.4. Культивирование вируса

1.3. ЭПИЗООТОЛОГИЯ.

1.4. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

1.4.1. Методы обнаружения антигенов вируса бешенства
1.4.2. Методы выделения вируса бешенства.
1.4.3. Методы обнаружения генома вируса
1.4.4. Обнаружение аитирабических антител.
1.5. ИММУНИТЕТ, МЕРЫ БОРЬБЫ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА.
1.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Отработка условий получения антигенов вируса бешенства для ИФД.
3.2. Синтез протеин Апероксидазного коньюгата.
3.3. Получение контрольных сывороток для иммуиоферментной тестсистемы
3.4. Разработка иммуиоферментной тестсистемы для
количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых кошек и собак
3.4.1. Отработка оптимальных условий постановки непрямого ИФА .
3.4.2. Определение допустимых значений оптических плотностей контрольных сывороток.
3.4.3. Определение аналитической чувствительности тестсистемы непрямого ИФА
3.4.4. Определение аналитической специфичности тестсистемы непрямого ИФА
3.5. Количественное определение антирабических антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых кошек и собак
. 3.5.2. Результаты количественного определения антител к вирусу
бешенства и гликопротеину в непрямом ИФА.
3.6. Применение разработанной тестсистемы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых
против бешенства кошек и собак
3.6.1. Определение уровня антирабических антител в сывортках крови привитых против бешенс тва кошек и собак
3.6.2. Определение уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных коров
3.7. Исследование эффективности применения иммуноферментной тестсистемы и для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЯ.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АГ антиген
АГИФА антиген для ИФА
БСА бычий сывороточный альбумин
Б бешенство
ВНИТИБП Всероссийский научноисследовательский и технологический институт биологической промышленности
ВОЗ Всемирная организация здравоохранения
В В вирус бешенства
В НА вируснейтрализующие антитела
ГА гемагглютинирующая активность
о.е.ИФА оптические единицы иммуноферментного анализа
ЗФР забуференный физиологический раствор
ФБР фосфатный буферный раствор
ИФА иммуноферментный анализ
ИФ иммунофлюоресценция
ИМиммуно1тсроксидазныи метод
ТФИФА твердофазный иммуноферментный анализ
I Щтканевая цитопатическая доза
ГХИФА гистохимический иммуноферментный анализ
ГП гликопротеин
гликопротеин
ИММиммунопероксидазный монослойный метод кДа килодальтон
КРС крупный, рогатый скот
КСА комплеменгсвязыпающие антитела м.м. молекулярная масса мАТ моноклональные антитела
МФА метод флюоресцирующих антител
МЭБ между народное эпизоотическое бюро
НМФА непрямой метод флюоресцирующих антител
НК нуклеокапсидный комплекс
РФ Российская Федерация
РА реакция агглютинации
реакция нейтрализации
РДП реакция диффузной преципитации
РНГА реакция непрямой гемагглютииации
РНИФ реакция непрямой нммунофлюоресценции
УЗ ультразвук
ПЦРполимеразная цепная реакция
ОТПЦР обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция
ПИ дни после иммунизации
ПВ дни после вакцинации
ПЛАТ полиакриламидный гель
ДСНГ1ААГ полиакриламидный гель в денатурирующих условиях
ПА прении итирующие антитела
НК нуклеопротеидный комплекс
НАРВАКнаучнопроизводствеиное объединение 1АРВАК
МЭБ Международное эпизоотическое Бюро
1 иммуноглобулин
иммуноглобулин в
А иммуноглобулин А
1М иммуноглобулин М мАТ моноклональные антитела
НЬ тяжелые и легкие цепи II тяжелая цепь
ОФД ортофенилендиамин
ОП0 .оптическая плогцоеть при 0 нм
ПЭГ полиэтилеигликоль молекулярной массой дальтон СУБ штамм вируса бешенства СУБ
ЦНС центральная нервная система
ФБРТ твинфосфатпый буферный раствор
ФИТЦ флюоресцеинизоционат
ЭМ электронная микроскопия
ВНК перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка.
ВВЕДЕНИЕ


СОДЕРЖАНИЕ. СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ. ВВЕДЕНИЕ. Эпизоотическая обстановка по бешенству в РФ. Эпидемиологическая ситуация бешенства гидрофобии в Российской Федерации. Устойчивость вируса. ЭПИЗООТОЛОГИЯ. Методы выделения вируса бешенства. Обнаружение аитирабических антител. ИММУНИТЕТ, МЕРЫ БОРЬБЫ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. Отработка условий получения антигенов вируса бешенства для ИФД. Синтез протеин Апероксидазного коньюгата. Отработка оптимальных условий постановки непрямого ИФА . Определение допустимых значений оптических плотностей контрольных сывороток. ИФА. Исследование эффективности применения иммуноферментной тестсистемы и для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. ПРИЛОЖЕНИЯ. КСА комплеменгсвязыпающие антитела м. ОП0 . ВНК перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка. Актуальность темы. В Российской Федерации на протяжении последних лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенством среди животных и возникновения случаев заболевания людей. Несмотря на то, что основными резервентами и распространителями рабического вируса остаются дикие хищники семейства псовых, все чаще вовлекаются в эпизоотический процесс домашние животные собаки и кошки 1,2,8,,. В году, по сравнению с годом, число заболевших бешенством животных увеличилось в 3,7 раза с до случаев. Интенсивность распространениябешенства домашних животных находится в прямой зависимости от численности безнадзорных собак и кошек 8,,,,,. В гг в Российской Федерации увеличилось количество неблагополучных пунктов по бешенству собак и кошек до ,4. Бешенство среди различных видов животных регистрировалось в году на территории субъектов РФ. Основными средствами контроля бешенства среди домашних и диких животных являются специфическая профилактика, обеспечивающая устойчивость животных к заражению бешенством, и лабораторная диагностика. Однако применение антирабических вакцин и эффективных схем иммунизации животных, часто недостаточно изза гетерогенности популяционной и индивидуальной защиты животных ,. Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейтрализующих антител является фактором эффективности вакцинации, так как только вируснейтрадизующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции ,9. МЕмл, считается минимальным уровнем протективного антирабического иммунитета ii Vi, 0. С года обязательными условиями, подлежащими исполнению при ввозе домашних животных кошек, собак, домашних хорьков из стран, не входящих в Европейский Союз, являются наличие имплантированных микрочипов и содержание вируснейтрализующих антител в сыворотке крови не менее 0,5МЕмл Регламент Совета и Европейского парламента,. Для определения антител в сыворотках крови к вирусу бешенства, ВОЗ рекомендует использовать реакцию нейтрализации i viv II i мышах и тесты i vi на культуре клеток тест ингибиции фокусов флюоресценции iiii I и тест флюоресценции вируснейтрализующих антител V ,,,,9,0. Постановка тестов i vi требует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени дня, необходимости поддержания культуры клеток, использования вирулентного вируса. Постановка на мышах трудоемка, длительна во времени день, требует живого вируса и значительного количества мышей, что увеличивает стоимость анализа. В практике применяются традиционные методы определения антирабических антител, такие как РИГА, РСК, РНИФ, РДП ,. Для решения аналогичных задач предложены методы иммуноферментного анализа, основанные на использовании целого вируса бешенства, или и его оболочечного белкагликопротеина белок , однако, эти методы пригодны для качественного определения антител, но не позволяют количественно определять наличие антител против бешенства в сыворотках крови животных после вакцинации 3,,,,,,,3.