Лигандообменное разделение рекомбинантных белков без применения хроматографии

• Автор: Пуртов, Константин Викторович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 121 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ.

1.1. Методы разделения белков

1.2. Лигандообменная хроматография, общие принципы метода .

1.3. Применение принципов лигандообменной хроматографии при разделении белковых молекул.
1.4. Очистка рекомбинантных белков, включая белки Са активируемой фотопротеиновой группы апообелин и апоакворин.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА ЛОРБ И ПРОВЕРКА ЕГО

ПРИМЕНИМОСТИ НА ПРИМЕРЕ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ

МАРКЕРНЫХ БЕЖОВ.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИМЕНИМОСТИ МЕТОДА ЛОРБ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ Са2АКТИВИРУЕМЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ И ИХ МУТАНТНЫХ ФОРМ ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК .i
4.1. Очистка апообелина. .
4.2. Сравнение метода ЛОРБ с хроматографическим методом
4.3. Сравнение биохимических характеристик апообелина, полученного разными методами
4.4. Выделение апоакворина.
4.5. Очистка мутантов апообелина и апоакворина.
ГЛАВА 5. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЛОРБ ДЛЯ ОЧИСТКИ
РЕКОМБИНАНТНОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ ИЗ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК К i.
ГЛАВА 6. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ
РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЖОВ МЕТОДОМ ЛОРБ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ. 6.
ЛИТЕРАТУРА


Хорошее отделение от примесей было достигнуто при очистке стероидизомеразы путем связывания эстрадиола с полиэтиленгликолем и растворения этого конъюгата вместе с декстраном в препарате неочищенного фермента . Это мягкий и быстрый метод. Хорошая степень очистки достигается, если большая часть примесей уходит в фазу, не содержащую связанного лиганда. С другой стороны, возникают проблемы, связанные с отделением фермента от растворимого комплекса полимерлиганд, и эта методика вряд ли превосходит по степени разрешения технику аффинной адсорбции. Однако, поскольку она не связана с адсорбцией на твердой фазе, условия оказываются мягче и более пригодными для лабильных белков. В частности, ее можно использовать для разделения фракций частиц, связанных с мембранами. При этом можно применять мутные суспензии. Одноступенчатое распределение обычно дает неудовлетворительные результаты, если только не происходит крайне неравномерного распределения компонентов между двумя фазами. Если бы. Поначалу казалось, что жидкостножидкостная хроматография в этих условиях неосуществима. Однако на самом деле это не так, и ее можно осуществить, если одна из жидких фаз будет иммобилизована. Такой метод оказался успешным при разделении нуклеиновых кислот , и нет оснований считать, что его нельзя применить к белкам. Подходящий носитель, подобный шарикам агарозы, уравновешивают с одной из фаз, а другую фазу используют как буфер для пропускания через колонку. Поверхностное натяжение препятствует смешиванию двух компонентов. Обогащенная декстраном фаза остается внутри шариков или непосредственно у их поверхности. В такой колонке возможно простое распределение белков, однако, аффинное распределение должно быть даже более эффективным. Система очень сходна с обычной аффинной хроматографией,, и единственное различие между ними заключается в том, что связанный лиганд не присоединен ковалентно к твердому носителю, а сохраняет растворимую форму и удерживается между гранулами носителя. Метод ультрафильтрации с использованием давления газа для продавливания жидкости через мембрану также используется для разделения белков . Если поры в мембране таковы, что более мелкие молекулы белка проходят через нее с ультрафильтратом, то достигается разделение белков. Молекулы большего размера удерживаются и концентрируются по отношению к исходному раствору. Поскольку в ультрафильтрационной мембране имеется некоторый разброс размеров пор, не существует резкой границы пропускания Часть молекул с размерами, близкими к размерам пор в области пропускания, будет проходить через мембрану, а остальные останутся в исходном растворе. Однако если у нужного белка размер молекул значительно меньше или больше, чем установленный верхний предел пропускания, тогда почти весь белок окажется или в ультрафильтрате, или в удержанном растворе . По своей разделительной способности этот метод, безусловно, хуже, чем гельфильтрация, основанная на том же принципе разделение молекул в соответствии с их размерами, так как он позволяет получить только две фракции более крупные молекулы и более мелкие молекулы. Вместе с тем в некоторых случаях он имеет ряд преимуществ, особенно если получен большой объем разбавленного раствора белка, например, раствор, элюированный с адсорбционной колонки. Прежде чем подвергать этот раствор гельфильтрации, его нужно сконцентрировать. Это можно сделать с помощью ультрафильтрации, причем если выбрать мембрану так, чтобы она задерживала только нужный белок, то отделение белков с молекулами меньших размеров можно осуществить без дополнительных усилий. Ультрафильтрация особенно полезна при очистке белков больших размеров . Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых разных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение таких методов часто позволяет получить наибольшую степень очистки белков, что в случае ферментов означает максимально возможное повышение их удельной активности.