Иммунохимические методы анализа пестицидов группы ДДТ в объектах окружающей среды

• Автор: Бочкарева, Александра Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 150 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Иммунохимические методы анализа пестицидов

1.1. Основные этапы разработки иммунохимических методов анализа пестицидов

1.1.1. Дизайн и синтез гаптенов, конъюгирование гаптенов с белками

1.1.2. Получение антител

1.1.3. Тестирование антител оптимизация иммуноанализа

1.2. Твердофазный иммуноферментный анализ ИФА

1.2.1. Хемилюминесцентный ИФА

1.3. Твердофазный ИФА в проточных системах

1.3.1. Иммуносорбенты и методы иммобилизации

1.3.2. Неспецифическое связывание в проточных системах
1.3.3. Стабильность реагентов в условиях проточного иммуноанализа
1.3.4. Регенерация иммуносорбентов
1.4. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ ПФИА
1.4.1. Влияние структуры трейсера на чувствительность ПФИА
ГЛАВА 2. Общая характеристика ДДТ, производных и метаболитов
2.1. Физикохимические свойства Д ДТ и его основных производных
2.2. Метаболизм и транспорт ДДТ в окружающей среде
2.3. Метаболизм ДДТ и производных в живых организмах
2.4. Механизм инсектицидного действия ДДТ
2.5. Механизмы токсического действия ДДТ на живые организмы
ГЛАВА 3. Методы определения ДДТ в различных природных объектах
3.1. Физикохимические методы анализа ДДТ
3.2. Иммунохимические методы анализа ДДТ
ГЛАВА 4. Материалы и методы
4.1. Материалы и оборудование
4.2. Методы исследования
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ ПФИА ДДТ и производных
5.1. Получение меченых производных ДДТ
5.2. Тестирование моноклональных антител против ДДТ
5.3. Исследование специфичности ПФИА ДДТ
5.4. Аналитические характеристики ПФИА ДДТ
ГЛАВА 6. Твердофазный иммуноферментный анализ ДДТ
6.1. Оптимизация ИФА ДДТ
6.1.1. Изучение сорбционного поведения конъюгата на поверхности планшетов исследование влияния температуры и времени проведения стадий на вид калибровочных кривых ИФА ДДТ
6.1.2. Исследование влияния физикохимических факторов на стадию конкуренции
6.1.3. Влияние органических растворителей на чувствительность твердофазного ИФА ДДТ и суммы производных ДДТ
6.1.4. Исследование специфичности твердофазного ИФА ДДТ
6.1.5. Стабильность ИФА ДДТ
6.2. Твердофазный ИФА ДДТ в водах различного происхождения
6.2.1. Твердофазный ИФА ДДТ в водопроводной и минеральной воде
6.2.2. Твердофазный ИФА ДДТ в поверхностных водах
6.3. Твердофазный ИФА ДДТ в почве и продуктах питания
ГЛАВА 7. Иммуноферментный анализ ДДТ в проточной системе
7.1. Получение и свойства носителей для ИФА Д ДТ в проточной системе
7.2. Выбор схемы проведения иммуноферментного анализа ДДТ в проточной системе
7.2.1. Конкурентная схема ИФЛ ДДТ в проточной системе с использованием конъюгатов антивидовых антител с нероксидазой хрена
7.2.2. ИФА ДДТ в проточной системе с использованием конъюгатов моноклональных антител с пероксидазой хрена
7.2.2.1. Получение и тестирование конъюгатов моноклональных антител с пероксидазой хрена методом твердофазного ИФА на планшетах
. Тестирование конъюгатов антител против ДДТ с пероксидазой в проточной системе
7.3. Оптимизация условий проведения ИФА ДДТ в проточной системе
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Для синтеза конъюгатов с белковым носителем или с меткой используют как гомологичные, так и гетерологичные гаптены. Для получения гетерологичных конъюгатов обычно используют гаптены, отличающиеся от гаптенов в иммуногене I электронными или пространственными характеристиками 2 позицией введения спейсерного мостика 3 химической структурой, длиной и размерами спейсерного мостика. Кроме того, определенной степени гетерологии с иммуногеном достигают, изменяя способ введения гаптена в молекулу белканосителя. Использование гетерологичных гаптенов позволяет, как правило, разрабатывать более чувствительный иммуноанализ по сравнению с гомологичными, однако, данная закономерность не всегда выполняется 8. Общим требованием для всех гаптенов является их стабильность в условиях конъюгирования с белкаминосителями, при иммунизации и в условиях иммуноанализа. Определенные ограничения при выборе структуры гаптенов накладывают доступность метаболитов и производных пестицида, необходимых для синтеза гаптенов, а также в целом возможности синтетической органической химии. Следует отметить, что антигенная специфичность антител определяется целым рядом факторов, поэтому всегда рекомендуется проводить скрининг нескольких гаптенов. Пестициды, как низком о лекулярпые соединения, приобретают способность индуцировать иммунный ответ только после конъюгирования С беЛКОхМНОСИТСЛеМ. В качестве инертных белков для конъюгирования с пестицидами обычно применяют сывороточные альбумины, гемоцианин, овальбумин, тироглобулин и фибриноген. Используют также небелковые носители, такие как липосомы 9 и декстран . Мольное соотношение пестицидбелок оказывает значительное влияние на физикохимические характеристики конъюгатов. С одной стороны, конъюгаты с минимальным содержанием антигенных групп обладают низкими кинетическими характеристиками в реакции антигена с антителами. С другой стороны, высокая поверхностная плотность антигенных детерминант увеличивает вероятность бивалентного связывания. Для бычьего сывороточного альбумина БСА оптимальное мольное соотношение пестицидбелок составляет 1 1, для больших по размерам молекул, таких как гемоциапии, 1. Для конъюгатов пестицидфермент предпочтительна низкая антигенная плотность . Специфические антитела обычно получают иммунизацией животных. Именно качество антител в значительной степени определяет чувствительность и специфичность анализа . Поликлональные антитела, получаемые после иммунизации, представляют собой набор антител, гетерогенных как по структуре активных центров, так и по физикохимическим свойствам, что обуславливает определенные трудности в получении воспроизводимых стандартных препаратов антител. Развитие гибридомных и генноинженерных технологий позволило получать моноклональные и рекомбинантные антитела, специфичные к строго определенному участку антигена. Следует отметить, что физикохимические характеристики рекомбинантных антител могут быть изменены в соответствии с конкретными исследовательскими целями. Основным достоинством моноклональных и рекомбинантных антител является возможность их получения в неограниченных количествах с идентичными от партии к партии физикохимическими характеристиками. Это позволяет создавать на их основе стандартные реагенты . Наряду с антителами в последнее время используются их полимерные аналоги, так называемые импринтингполимеры. В ходе импринтинга пестицид сначала ковалентно связывается с функциональными мономерами, затем проводится соиолимеризация реакционной смеси с кросссшивающими мономерами. На заключительной стадии проводят отмывку полимера от молекул пестицида. Таким образом, в молекулах имиринтингполимеров образуются полости, комплиментарные молекулам пестицида. Высокоустойчивые синтетические импринтингполимеры применяются в иммуноаффинной хроматографии и иммуносенсорах . Тестирование полученных иммунореагентов антител и гаптенов проводят в неконкурентных в отсутствие определяемого пестицида и конкурентных условиях и выбирают комбинации иммунореагентов, которые отвечают поставленным перед иммуноанализом задачам.