Получение рекомбинантных факторов роста мышц

• Автор: Кузнецова, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 178 с. : ил.

1 Введение Ю

2 Обзор литературы

2.1 Активин фоллнетатиноваи система регуляции роста и

диффереицировки мышц

2. . 1 Миостатин как член семейства активинподобных белков

2.1.2 Структура и механизм действия фоллистатина

2.1.3 Ингибины

2.1.4 Передача сигнала активина

2.2 ЮРсоматотропиновая система регуляции роста и

диффереицировки мышц

2.2.1 Структура и механизм действия гормона роста

соматотропина
2.2.2 Структура и механизм действия инсулиноподобного
фактора роста I
2.2.3 Механический фактор роста продукт альтернативной
спяайсоформы гена I
2.2.4 Исследования взаимодействий фоллистатин
миостатиновой и I1соматотропиновой систем регуляции роста мышц
2.3 как модельный объект для разработки методики получения рекомбинантных факторов роста
2.3.1 Роль в защите от инфекционных и онкологических
заболеваний
2.3.2 Структурнофункциональная организация и его
рецепторов
2.3.3 Экспериментальные способы получения и
тестирование его активности i viv
2.3.4 Использование колебаний уровня для диагностики и
особенности тестсистем для выявления в биологических жидкостях
2.4 Экспериментальные мегоды воздействия на систему
регуляции роста мышц
2.4.1 Гистологическая структура мышечной ткани и ее
свойства в качестве объекта физиологических воздействий
2.4.2 Силовая тренировка и разгрузка
2.4.3 Методы электростимуляции мышц
2.4.4 Фармакологические методы стимуляции мышечной
гипертрофии
Материалы и методы
3.1 Генноинженерное конструирование
3.1.1 Выделение плазмидной ДНК вариант мипипреп
3.1.2 Выделение геномной ДИК из селезенки человека и мыши
3.1.3 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
3.1.4 Переосаждение ДНК
3.1.5 ОбработкаДНК ре стриктазами
3.1. б Постановка ПЦР
3.1.7 Электрофорез ДНК
3.1.8 Секвенирование ДНК
3.1.9 Сборка конструкции и
3.1. Сборка конструкции
3.1. Сборка конструкции , ,
,
3.2 Культивирование клеток ii i и первичная переработка биомассы
3.2.1 Поддержание штаммов Е. i
3.2.2 Трансформация пяазмидными конструкциями и
поддержание плазмидных продуцентов
3.2.3 Культивирование и первичная переработка биомассы
штаммов, продуцирующих рекомбинантный белок в
форме тел включения
3.2.4 Культивирование и первичная переработка биомассы
штаммов, продуцирующих рекомбинантный белок в
растворимой форме
3.3 Физикохимические методы очистки и характеристики
рекомбинантных белков
3.3.1 Денатурирующий белковый электрофорез в ПААГ
3.3.2 Методика колориметрического определения содержания
белка по модифицированному методу Лоури с бицинхониновой кислотой
3.3.3 Солюбилизация тел включения в денатурирующих
условиях
3.3.3.1 Восстановление внутримолекулярных дисульфидных
связей при помощи ДТТ
3.3.3.2 Разрыв дисульфидных связей в белках смесью
тетратионата и сульфита натрия сульфитопиз
3.3.4 Хроматография в денатурирующих условиях
3.3.5 Ренатурация рекомбинантных белков
3.3.5.1 Ренатурация ТИРа
3.3.5.2 Ренатурация МОР
3.3.6 Хроматография в неденатурирующих условиях
3.3.7 Металлоаффииная хроматография
3.3.8 Высокоэффективная жидкостная хроматография
3.3.9 Идентификация белков по первичной структуре методом
МАШ1ТОР
3.4 Иммунохимические методы характеристики рекомбинантных
3.4.1 Получение антител
3.4.2 Твердофазный гшмунофермептный анализ
3.4.2.1 Твердофазный иммуноферментпый анализ типа
сэндвич для выявления сывороточного ТИРа
3.4.2.2 Твердофазный иммуноферментный анализ типа
сэндвич для выявления бНнСРРМЗТМ
3.5 Получение и тестирование аффинных сорбентов для удаления
миостатипа
3.6 Исследования биологической активности рекомбинантных
белков на культурах клеток эукариот
3.6.1 Цитотоксический тест с ТИРа на клеточной линии Р9
3.6.2 Тестирование биологической активности МСР по
стимулированию пролиферации культивируемых линий нормальных миобластов человека
Результаты и их обсуждение
4.1 Разработка методической платформы для получения рекомбинантных факторов роста на модели человека
4.1.1 Экспрессия гена человека в . i
4.1.2 Солюбилизация тел включения, содержащих 9 рекомбинантный белок
4.1.3 Ионообменная хроматография рекомбинантных белков в
денатурирующих условиях
4.1.4 Ренатурация белков i vi го методом разбавления
4.1.5 Ионообменная хроматография рекомбинантных белков в
нативных условиях
4.1.6 Оценка эффективности ренатурации рекомбинантного
методом определения биологической активности
4.1.7 Разработка твердофазной иммунохимической тест
системы для определения содержания в биологических жидкостях
4.2 Получение механического фактора роста мышц
4.2.1 Экспрессионная конструкция для получения
в клетках . i
4.2.2 Хроматографическая очистка и биологическая
активность
4.3 Получение аффинных еорбентов для удаления мпостатнпа
4.3.1 Получение активинсвязывающего домена фоллистатина
и пропептида миостатина
4.3.1.1 Получение рекомбинантного продукта конструкции
4.3.1.2 Получение рекомбинантного продукта конструкции
р
4.3.2 Хроматографическая очистка лигандов миостатина
6i и 6i
4.3.3 Иммобилизация 6i и 6i на
сефарозе
4.3.4 Получение миостатина в виде слитого белка в клетках
. i
4.3.5 Определение емкости и специфичности сорбентов
5 Заключение
6 Выводы
7 Список литературы
8 Благодарности
Список используемых


Одной из систем контроля процессов развития и размножения является сигнальная система, основными элементами которой являются активины и фоллистатин. В основе этой системы лежит генерация, передача и модуляция сигнала, передаваемого за счет ростовых факторов семейства i . К этому семейству относятся различные но функциональному назначению белки, обладающие сходной структурой Рис. В рамках настоящего обзора будет рассмотрена роль активинов и ингибинов, принадлежащих к указанному семейству. В настоящее время накоплен большой объем экспериментальных данных о структуре и функциях активинов, механизмах регуляции их активности . С учетом предполагаемого сходства этих механизмов для всех членов семейства ростовых факторов мы сочти целесообразным привести наиболее существенные факты, касающиеся структуры и функций активина. Рис. Миостатин как член семейства активинподобных белков Открытие активинов состоялось в конце х годов в связи с их способностью активировать секрецию фолликулостимулирующего гормона ФСГ клетками гипофиза и фолликулов , . В последствии был обнаружен ряд структурных гомологов активина, которые были объединены в семейство ростовых факторов . Сконцевая последовательность, содержащая особый мотив, богатый цистеиновыми остатками, и получивший название цистеиновый узел. Активины приобретают функциональную активность после специфического процессинга матриксными металлопротеинами ix i ММР и формирования гомодимера с молекулярной массой около кДа . Процессинг предшественника миостатина предположительно осуществляется за счет пока неидентифицированной матриксной металлопротеиназы, действие которой подавляется гидроксаматным ингибитором . При добавлении этого ингибитора в культуральную среду увеличивалась скорость слияния миобластов и формирования миотуб, что напоминало эффект от снижения концентрации миостатина в среде. Дальнейшие исследования с привлечением иммунохимических методов показали наличие в клетках значительного количества нспроцессированиого предшественника миостатина. В настоящее время существуют данные о том, что ММР2 является активатором мембранносвязанной металлопротеиназы 4, которая предположительно и отвечает за созревание предшественника миостатина i . В то же время существует и обратная связь активация ММР2 зависит от 4. Столь сложные связи между активностями ММР2 и 4 не позволяют уверенно прогнозировать результат от увеличения или снижения концентрации какоголибо из этих факторов в микроокружении миобластов. Однако можно предполагать, что такое воздействие может оказаться существенным для скорости и направления работы как фоллистатинактивиновой, гак и Iсоматогропиновой систем. Гомодимер активина состоит из двух однотипных 3субъединиц молекулярная масса около кДа. Л и В. Соответственно, при различных сочетаниях этих субъединиц образуются либо гомо, либо гетеродимеры. Так, активин А и активин В являются гомодимерами, состоящими либо из рсубъединиц типа А, либо из рсубъединиц типа В соответственно, а активин АВ гетеродимер, состоящий из рсубъединиц А и В. Субъединицы А и В кодируются разными генами в геноме человека ген субъединицы А расположен на хромосоме 7, а ген субъединицы В на хромосоме 2. Активин и его мРНК обнаружены во многих тканях яичники, семенники, плацента, гипофиз, ЦИС, надпочечники, костный мозг ваббуКш1епе1а1. Как и большинство ростовых факторов семейства ТвРР, зрелый миосгатин ТОРР8 представляет собой гомодимер молекулярной массой кДа. Ген, кодирующий субъединицу миостатина, расположен в хромосомной области 2ц. ТХтРР Соп2а1еБСабау1б а1. Вопрос о временной регуляции и гистоспецифичности экспрессии гена ТОРр8 в настоящее время не решен. Так, МсРЬеггоп и Ьее с помощью Иозернблотанализа показали, что у мышей, человека и некоторых других млекопитающих соответствующая мРНК в значительных количествах присутствует только в скелетных мышцах человека и не детектируется ни в сердечной мышце, ни в образцах ряда органов, содержащих гладкомышечные клетки мочевой пузырь, матка, желудок, тонкая и толстая кишка. Позднее в экспериментальных данных по этой теме возникли определенные противоречия. В г. Ьагта с соавт. Л с соавт.