Влияние типа экспланта и селективного агента на морфогенез и эффективность агробактериальной трансформации гвоздики ремонтантной (Dianthus caryophyllus L. )

• Автор: Мирошниченко, Дмитрий Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 149 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Методы переноса генов в растительный геном

1.1.1 Трансформация растений посредством i i

1.1.2. Баллистический метод переноса генов

1.3. Значение селективных маркеров для успешной трансформации растений

1.4. Морфогенез в культуре i vi

1.5. Регенерация адвентивных побегов из различных эксплантов гвоздики ремонтантной.

1.6. Трансформация гвоздики ремонтантной .

1.7 Применение методов генной инженерии для улучшения сортов цветочных культур

1.7.1. Изменение окраски цветов

1.7.2. Увеличение продолжительности жизни срезанных цветов
1.7.3. Устойчивость к вредителям и болезням
1.8. Заключение по обзору литературы
ГЛАВА 2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Объекты исследований
3.2. Культура i vi гвоздики ремонтантной
3.3. Адаптация растений к условиям i viv
3.4. Регенерация адвентивных побегов
3.6. Агробактериальные штаммы и плазмиды
3.7. Трансформация и селекция трансформантов
3.8. Флуориметрическое и гистохимическое определение активности
3.9. Выделение геномной ДК гвоздики
3 ПНР анализ трансгепных растений
3 Расчет частоты трансформации побегов
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Регенерация адвентивных побегов из лепестковых эксплангов гвоздики
4.1.1. Влияние фитогормонов на морфогенетический потенциал лепестковых эксплангов
4.1.2. Оценка регенерационного потенциала 8ми сортов гвоздики.
4.2. Регенерация адвентивных побегов из листовых эксплантов растений i vi гвоздики ремонтантной
4.2.1.Влияние фитогормонов на регенерацию побегов из листовых эксплантов i vi
4.2.2. Оценка регенерационного потенциала ти сортов гвоздики. Влияние гормонального состава среды
4.2.3. Влияние сочетаний концентраций БАП и ТДЗ на регенерацию из листовых эксплантов гвоздики ремонтантной
4.3. Влияние возраста эксплантов на эффективность регенерации гвоздики
4.3.1. Влияние возраста листовых эксплантов на эффективность регенерации. Сравнение эксплантов растений i vi и i viv трех генотипов гвоздики
4.3.2. Влияние возраста стеблевых эксплантов растений i viv на регенерационный потенциал трех г енотипов гвоздики
4.4. Оптимальный тип экспланта для эффективной регенерации адвентивных побегов у гвоздики ремонтантной
4.5. Генетическая трансформация гвоздики ремонтантной
4.5.1. Чувствительность эксплантов гвоздики к селективным агентам
4.5.2. Агробактериальная трансформация различных типов ткани гвоздики ремонтантной
4.5.2.1. Трансформация лепестковых эксплантов гвоздики
4.5.2.2. Трансформация листовых эксплантов гвоздики
4.5.2.3. Трансформация стеблевых эксплантов гвоздики
4.5.3. Влияние селективного агента на эффективность трансформации гвоздики ремонтантной
4.5.4. Влияние типа экспланта на эффективность агробактериаль
ной трансформации гвоздики
4.5.5. Изучение экспрессии в различных органах и тканях трансгенных линий г воздики ремонтантной
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В литературе имеется значительная информация о генах селективных маркерах позволяющих осуществлять эффективный отбор трансгенной ткани. Большинство генов селективных маркеров имеют бактериальное происхождение, поэтому успешная экспрессия в растительных клетках невозможна без использования соответствующих промоторов и терминаторов, изменения частоты кодонов и др. Среди известных растительных селективных маркеров наиболее распространен ген неомицинфосфотрансферазы I или подругому аминогликозидЗфосфотрансферазы II АРН3, клонированный из 5 . Этот фермент катализирует фосфорслирование З ОН положения ряда аминогликозидных антибиотиков, таких как канамицин, пеомицин, генетицин 8 и парамицин, что приводит к нарушению их функциональной активности v и др. Эти вещества способны связываться с рнбосомальной субединицей, препятствуя инициации трансляции, а соответственно и синтезу белка, вызывая хлороз и витрмфикацию листьев , . Среди антибиотиков этого ряда наиболее популярным селективным агентом является канамицин, который обычно применяют в концентрациях от до 0 мгмл и др. Восприимчивость растительных клеток к канамицину использовалась при трансформации большого числа видов. Однако ряд культур имеет высокую природную толерантность к этому веществу, что не позволяет использовать канамицин для успешной селекции. Ii и др. Нот и др. Некоторые исследователи при использовании гена применяют альтернативный аналог канамицина генетицин 8, который позволяет осуществлять более жесткий отбор трансформантов. Изза высокой токсичности, которую связывают с более эффективным связыванием с рибосомами, генетицин обычно используют в меньших концентрациях, а именно от до 0 мгл и др. Данный антибиотик помог увеличить эффективность трансформации многих видов растений, в первую очередь представителей злаковых и других семейств однодольных и др. Другие антибиотики канамицинового ряда, такие как парамицин и неомицин являются слабыми селективными агентами, и используются в тех случаях, когда растительные ткани гиперчувствите. В последнее время большую популярность в генетической инженерии растений приобретает ген гигромицин фосфо транеферазы НРТ, обеспечивающий устойчивость к аминогликозндному антибиотику гигромицину Б. Это соединение ингибирует белковый синтез в растительных клетках связываясь с фактором элонгации 2, препятствует транслокацин и вызывает ошибки трансляции i и vi, . Продукт гена также специфически фосфорилируст антибиотик, инактивируя его действие. Г ен . V и др. В известных нам работах для этого использовали концентрации от I до мгл гигромицина и др. Ген активно используется как селективный маркер в кассетах с хозяйственноценными генами. Гак, с применением гигромициновой селекции получены трансгенные растения риса, сои и капусты с генами токсинов , устойчивые к различным насекомымвредителям и др. Кроме того, недавно появилось сообщение о создании химерного гена с 2мя растительными нитронами, что полностью исключает его экспрессию в агробактериальиых клетках и одновременно с этим позволяет увеличить частоту трансформации, улучшить качество мРНК и уменьшает риск перехода этого гена в геном бактерий и животных. Такая конструкция гена успешно использовалась для регенерации вирусоустойчивых трансгенных растений риса и ячменя и др. Среди маркерных генов особое место занимают гены устойчивости к различным гербицидам, поскольку кроме использования в селекции трансгенных растений они имеют прямое практическое применение. Среди генов, определяющих резистентность к гербицидам, клонированы и успешно перенесены в растения гены устойчивости к глифосату коммерческое название и др. Однако в качестве геновмаркеров для селекции трансгенной ткани наибольшее распространение получили гены и , способные инактивировать фосфинотрицин РРТ иногда называемый глюфосинатом, активное вещество гербицидов , v, i, i и Ii. Эти гербициды блокируют метаболический путь с участием фермента глютаминсинтазы, нарушая процессы ассимиляции аммиака и фотосинтеза в растении. Это приводит к накоплению ионов , в растительных клетках, что приводит к их гибели ii и , .