Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. DC.)

• Автор: Инюшкина, Юлия Витальевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 98 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ботаническая характеристика семейства Вопасеае

бурачниковые.

1.2. Фитохимическая характеристика семейства i

1.3. Фармакологические свойства метаболитов кофейной

кислоты.

1.4. Биосинтез розмариновой кислоты и ее производных.

1.5. Цитохром Р0зависимые монооксигеназы растений.

1.6. Влияние гена гоС на трансформированные клетки растений.
1.7. Влияние элиситоров на продукцию вторичных метаболитов
в клетках растений.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования.
2.2. Бактерии и плазмиды.
2.3. Культивирование бактериальных штаммов.
2.4. Питательные среды.
2.5. Получение клеточных культур Е. зегсеит.
2.5.1. Получение контрольных и гоСтрана енных культур
Е. зегсеит.
2.5.2. Получение культуры трансгенных корней Е. зегсеит.
2.5.3. Получение клеточной линии Е4.
2.5.4. Динамика роста каллусных культур Е. зегсеит и
накопления ими полифенолов
2.6. Эксперименты с активаторами биосинтеза полифенолов
2.7. Выделение плазмидной ДНК
2.8. Доказательство трансгенности и экспрессия генов.
2.8.1. Выделение растительной ДНК
2.8.2. Полимеразная цепная реакция на препаратах ДНК.
2.8.3. Выделение тотальной растительной РНК.
2.8.4. Реакция обратной транскрипции
2.8.5. Полимеразная цепная реакция на препаратах кДНК.
2.8.6. Полимеразная цепная реакция в режиме реального
времени i
2.9. Секвенирование ДНК и кДНК.
2 Определение содержания полифенолов в культурах клеток
Е. i.
2 Исследование фармакологической активности метаболитов
кофейной кислоты из каллусной культуры Е. i
. Влияние препаратов из клеточной культуры
Е. i на функцию почек у крыс.
. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. i
на течение экспериментального острого воспаления.
. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. i
на процессы свободнорадикального окисления
2. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Характеристика клеточных культур Е. i
3.1.1. Клеточные культуры Е. i.
3.1.2. Доказательство трапсгснности культур Е. i.
3.1.3. Доказательство экспрессии гена в гоСтрансгенных культурах Е. i
3.2. Накопление полифенолов в культуре клеток Е. i
i 3.2.1. Содержание метаболитов кофейной кислоты в культурах
корней и каллусов Е. i.
3.2.2. Получение высокопродуктивной каллусной культуры Е. i методом селекции.
3.2.3. Влияние метилжасмоната и глицерата меди на продукцию метаболитов кофейной кислоты в культуре
клеток , i.
3.3. Изменение содержания метаболитов кофейной кислоты при
длительном культивировании каллусов.
3.4. Дифференциальная акгивация транскрипции специфических
изоформ генов вторичного метаболизма под действием гена
3.4.1. Экспрессия генов
3.4.2. Экспрессия генов
3.5. Фармакологические свойства препарата из клеточной культуры
Е. i и возможность ее применения в медицине
3.5.1. Стабильность рабдозина и розмариновой кислоты в
процессе сушки каллусов.
3.5.2. Влияние препарата из клеточной культуры Е. i на функцию почек у крыс
3.5.3. Влияние метаболитов кофейной кислоты из клеточной культуры Е. i на течение экспериментального
острого воспаления
3.5.4. Влияние препарата из клеточной культуры Е. i
на процессы свободнорадикального окисления.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Определение содержания полифенолов в культурах клеток
Е. Е. i на функцию почек у крыс. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Характеристика клеточных культур Е. Клеточные культуры Е. Доказательство трапсгснности культур Е. Доказательство экспрессии гена в гоСтрансгенных культурах Е. Накопление полифенолов в культуре клеток Е. Е. i. Получение высокопродуктивной каллусной культуры Е. Влияние препарата из клеточной культуры Е. Влияние метаболитов кофейной кислоты из клеточной культуры Е. Влияние препарата из клеточной культуры Е. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. ОПА общая прооксидшггная активность, п. С.О. Е. i, трансформированная пустым вектором, трансформированная культура Е. МАР митогенакгивированная протсинкиназа. Одним из перспективных направлений биотехнологии растительной клетки является получение вторичных метаболитов для фармацевтической промышленности. Это подход получает распространение в нашей стране и мире, поскольку создает воспроизводимый источник сырья для получения биологически активных веществ. Биотехнологическое получение вторичных метаболитов основано на том, что клеточные культуры растений сохраняют свойство целого растения синтезировать и накапливать эти вещества. Клетки растений можно выращивать неопределенно долго каллусы женьшеня растут в культуре i vi уже болсс лет, состав сред для них относительно прост, путем различных манипуляций часто удастся повысить содержание вторичных метаболитов. Кроме того, система растительной клетки i vi это удобная модель для изучения вторичного метаболизма клетки, поскольку исследователь может управлять ее функционированием через изменение условий культивирования или экспрессии генов. В настоящее время растет спрос на лекарственные препараты природного происхождения ix , . Экстракты лекарственных расгений широко применяют в медицине, парфюмерии и пищевой промышленности . Активно изучаются антиоксидантныс и прогивовосиалительные свойства растительных полифенолов, в том числе метаболитов кофейной кислоты Iv . Известно, что полифенолы растений перспективны для профилактики и лечения заболеваний почек, связанных с нефритом. Так, при лечении диабетической нефропатии применяются метаболиты кофейной кислоты розмариновая кислота и литоспермовая кислота Б i . На Дальнем Востоке это семейство представлено несколькими видами, в том числе нсзабудочником шелковистым iii i . Эти виды растений являются редкими и их промышленное использование невозможно. Поэтому разработка новых лекарственных средств на основе клеточных культур этих растений является перспективной задачей для биотехнологии. Современная биотехнология растений широко использует методы генетической инженерии. В большинстве случаев эти гены активируют биосинтетическую способность культур, однако также известны случаи ингибирования v, . К сожалению, информация о механизме действия продуктов этих генов на вторичный метаболизм очень ограничена. Влияние генов i на биосинтез вторичных метаболитов фенилпропаноидного пути ранее не исследовалось. В настоящей работе приведена сравнительная характеристика продукции метаболитов кофейной кислоты в обычной и гоСтрансгенной культурах клеток Е. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в культурах клеток незабудочника шелковистого и получение продуктивной клеточной линии. Получить контрольную и экспрессирующую ген культуры клеток Е. Увеличить выход метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. Исследовать связь между экспрессией гена и экспрессией некоторых ключевых генов биосинтеза метаболитов кофейной кислоты. Исследовать фармакологическое действие нолифенолов из культуры клеток Е. Основные положения, выносимые на защиту. Высокопродуктивная культура клеток Е. Е4 накапливает метаболиты кофейной кислоты в количестве до 6 от сухой массы ткани. Экспрессия гена в клетках Е. Ген вызывает активацию экспрессии специфической формы гена 3, ответственной за биосинтез розмариновой кислоты. Полифенолы культуры клеток Е.