Структурно-функциональное исследование коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов

• Автор: Мартынова, Кристина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Свойства пептидных фотоаффинных зондов.

1.1. Структурные требования к фотоаффинным зондам.

1.2. Фотоактивные производные арилазидов.

2. Фотоаффшшое мечение.

2.1. Характеристики поглощении фотоактивных зондов.

2.2. Аппаратурное оформление.

2.3. Условия облучения.

2.4. Необходимые контрольные эксперименты

2.5. Анализ продуктов фотоаффинного мечения белков.

3. Синтез фотоактивнруемых арилазидных зондов
4. Сравнение эффективности использования зондов с различными типами фотоактивных групп
5. Проблемы и ограничения метода фотоаффинного мечения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы.
2. Методы
2.1. Синтез фотоактивных производных семакса и РгоС1уРго
2.2. Фотолиз фотоактивных соединений.
2.3. Мечение бычьего сывороточного альбумина пазидо2,,6тстрафторбснзилМеМЛиТШРЬеРгоуРго XVII
2.4. Культивирование клеток
2.5. Радиорецепторный анализ.
2.6. Определение степени деградации семакса и РгоС1уРго в культуре клеток РС
2.7. Моделирование окислительного стресса в культуре клеток РС
2.8. Моделирование глутаматной экзайтотоксичности в культуре первичных нейронов мозжечка
2.9. Определение уровня внутриклеточного Са
2 Определение жизнеспособности клеток в культуре РС
2 Статистический анализ данных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Тсстсисгемы для исследования нейропротективного действия глицин и пролннсодержащих пептидов
1.1. Модель гибели клеток под действием окислительного стресса.
1.2. Модель глутаматной экзайтотоксичносги.
2. Исследование влияния пептида РгоС1уРго и его производных на выживаемость перевиваемых культур клеток крысы в условиях окислительного стресса.
2.1. Влияние РгоС1уРго и его производных на выживаемость культуры клеток РС.
2.2. Влияние РгоС1уРго и его производных на выживаемость культуры ИаЬ
3. Структурнофункциональное исследование синтетических глицин и пролннсодержащих пептидов на модели окислительного стресса.
4. Поиск мест специфического связывания пептидов РгоС1уРго и семакса с клетками РС
4.1. Влияние ингибиторов протеаз на стабильность РгоС1уРго и семакса в культуре клеток
4.2. Выбор оптимальной среды для проведения радиорецепторного
анализа
4.4. Связывание радиоактивномеченых РгоС1уРго и семакса с клетками РС
5.1. Синтез фотоактивных производных РгоФуРго и семакса
5.2. Фотолиз фотоактивных производных РгоС1уРго и семакса
5.3.Взаимодействие фо гоактивного производного семакса с бычьим сывороточным альбумином
6. Оценка биологической активности тетрафторарилазидных производных РгоС1уРго и семакса.
6.1. Цитопротективное действие фотоактивных производных на модели окислительного стресса.
6.2. Нейропротективное действие фотоактивных производных в модели глутаматной экзайтотоксичности.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ .
СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Было показано, что глицин пролинсодержащие пептиды обладают рядом биологических активностей, представляющих большой практический интерес. Так, например, пептиды РгоС1у, С1уРго, РгоуРго и уРгоуу способны подавлять процессы свертывания крови Ргоу, РгоСуРго и С1уРгоуу защищать слизистую желудка от различных ульцерогенных воздействий и поддерживать ее гомеостаз 9, пептиды РгоС1уРго и С1уРго нормализовать поведение при стрессорных воздействиях , а циклический пептид Ргоу оказывать когнитивное действие . Присоединение глицин и пролинсодержащих последовательностей к Сконцу ряда биологически активных пептидов позволило увеличить их устойчивость к действию протеаз. При этом было обнаружено, что эффекты регуляторного фрагмента дополняются эффектами глицин и пролинсодержащей последовательности . Примером такого комбинированного пептида является семакс. В настоящее время механизмы действия глипролинов и их мишени мало изучены. Важной задачей также является создание синтетических аналогов глипролинов с высокой стабильностью, эффективностью и селективностью действия. Такие исследования целесообразно проводить на моделях i vi с использованием клеточных культур. Ранее было показано, что пептид оказывал цитопротсктивное действие на нейронально дифференцированные клетки феохромоцитомы крысы при окислительном стрессе ОС , а также препятствовал развитию отсроченной Садизрегуляции, индуцированной глугаминовой кислотой . Эти данные дают основание рассматривать глипролины в качестве потенциальных нейропротекторов. Однако систематических исследований нейропротективных свойств глипролинов ранее не проводилось. Также нам представлялось интересным получить фотоаффинные зонды глипролинов для последующего поиска и идентификации специфических мишеней глипролинов на нейрональных клетках. Цели и задачи исследован ни. Целями настоящей работы было выявление характерных особенностей строения коротких глицин и нролинсодержащих пептидов, проявляющих нейропротективное действие на моделях повреждения нейронов i vi, а также получение фотоаффинных зондов, пригодных для поиска специфических мишеней таких пептидов. Исследовать связывание радиоактивномеченых пептидов и семакса с культивируемыми клетками . Метод фотоаффинного мечения часто используется для изучения взаимодействий биологически активных лигандов с их рецепторами. Так, в предметном указателе Ix базы данных i этот термин был ранее расположен под заголовком Аффинность вместе с родственными терминами, такими как аффинное мечение и аффинная колонка. Однако впоследствии начиная с г. Использование метода фотоаффинного мечения позволяет получить не только общие характеристики мест специфического связывания лигандов константу диссоциации, количество мест специфического связывания и др. В основе данного метода лежит получение ковалентных сшивок между рецептором и присоединенным к нему фотоактивным лигандом под действием облучения, и последующая идентификация меченых продуктов. Для получения фотоактивного лиганда так называемого зонда необходимо введение в пептид фотолабильной группы, которая активируется под действием облучения с образованием высокореакционноспособного интермедиата, способного атаковать различные группы атомов. Зонды, используемые в фотоаффинном мечении, состоят из распознающей части радиоактивномеченого пептида, взаимодействующей с лигандсвязывающим участком белка и фотоактивной фотолабильной группы, которая при облучении УФ светом образует химически активный интермедиат, формирующий ковалентные связи внутри или вблизи этого участка. Предполагается, что при модификации природного лиганда фотоактивной группой сохраняются основные структурные элементы, определяющие сродство лиганда к рецептору . В ходе развития метода фотоаффинного мечения были предложены различные фотоакгивные группы, наиболее распространенными из которых являются арнлазидные, феннлдиазнриновые и кетогруппы. Такое разнообразие фогоактивных групп позволяет проводить облучение при различных длинах волн и получать различную эффективность мечения , рис.