Разработка технологии иммуноферментной тест-системы для выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота

• Автор: Третьякова, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика аденовирусов

1.2. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота.

1.3. Структурная характеристика аденовириона

1.3.1. Строение нуклеокапсида

1.3.2.Физикохимические свойства структурных белков аденовириона

1.3.3. Основной структурный белок аденовириона гексон

1.3.4. Структурные белки аденовириона.

1.4. Иммунохимические свойства аденовирусных белков
1.4.1. Антигенная структура белков аденовирусов.
1.4.2. Антигенные свойства гексона
1.5.Основные методы диагностики вирусных болезней
животных.
1.5.1. Лабораторная диагностика аденовирусной инфекции
крупного рогатого скота.
1.6. Иммуноферментный анализ
1.7. Иммуноферментный анализ, как метод диагностики
аденовирусной инфекции
1.7.1. Иммуноферментный анализ, как метод выявления
антител к аденовирусам крупного рогатого скота
1.7.2. Иммуноферментный анализ, как метод обнаружения
аденовирусных антигенов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Биологические препараты
2.1.2. Реактивы.
2.2. Методы исследования
2.2.1. Получение монослойной культуры клеток перевиваемой линии МГВК
2.2.2. Получение монослойной культуры клеток перевиваемой
линии Т1
2.2.3. Получение монослойной культуры клеток ТБ.
2.2.4.Культивирование аденовируса крупного рогатого скота первого серотипа.
2.2.5.Культивирование аденовируса крупного рогатого скота седьмого серотипа
2.2.6.Экстракция гексонов аденовирусов
2.2.7 .Гидрофобная хроматография
2.2.8. Анионообменная хроматография.
2.2.9. Электрофорез в полиакриламидном геле.
2.2 Непрямой иммуноферментный анализ
2.2 Реакция нейтрализации.
2.2 Реакция непрямой гемагглютинации.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Культивирование аденовирусов первой и второй подгрупп.
3.1.1. Культуры клеток
3.1.2. Методы культивирования аденовирусов
3.2. Получение реагентов набора ИФА.
3.2.1. Получение аденовирусных антигенов
3.2.2. Получение гипериммунных сывороток к гексонам аденовирусов
3.2.3. Определение оптимальных условий проведения ИФА
3.3. Апробация набора реагентов ИФА.
3.4. Сравнительная характеристика метода ИФА
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Современный уровень развития биотехнологии позволяет разработать значительно более эффективный экспресстест для серологических исследований при аденовирусной инфекции и иммунологического мониторинга при вакцинопрофилактике на основе непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с принципиально новыми подходами к качеству реагентов. Целью исследований являлась разработка технологии изготовления специфических реагентов и создание на их основе иммуноферментной тестсистемы для выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота первой и второй подгрупп в сыворотке крови. Провести скрининг культур клеток, чувствительных к аденовирусам двух подгрупп, и определить эффективный способ культивирования. Выделить и очистить из культуральной вируссодержащей суспензии основной структурный белок аденовируса гексон. Получить гипериммунные сыворотки к гексону аденовируса на основе оптимизированной схемы иммунизации телят. Разработать условия проведения реакции по методу непрямого ИФА с полученными реагентами. Определить диагностическую ценность и апробировать набор реагентов ИФА для выявления антител к аденовирусам в пробах сывороток крови крупного рогатого скота, полученных от экспериментально, спонтанно инфицированных животных и вакцинированных животных. Научная новизна результатов исследования. Показано, что использование техники культивирования перевиваемых клеток в суспензии и на микроносителях существенно повышает инфекционную активность аденовирусов и сокращает сроки репродукции Авт. Способ выращивания вирусов возбудителей респираторных и кишечных инфекций крупного рогатого скота, 9 от г. Впервые в качестве антигенов в методе ИФА для выявления специфических антител в сыворотке крови крупного рогатого скота использованы структурные белки аденовирусов первого ВАУ1 и седьмого ВАУ7 серотилов гексоны, позволяющие дифференцировать антитела к аденовирусам первой и второй подгрупп. Оптимизирована схема получения гипериммунных сывороток к гексонам аденовирусов крупного рогатого скота на телятахдонорах для использования в качестве специфических референссывороток. Оптимизированы условия адсорбции гексонов на полистирольных планшетах и условия их хранения в виде соединения гексонтвердый носитель. Установлены значения диагностического и поствакцинального титра антител, характеризующего напряженность иммунитета животных к аденовирусной инфекции. Практическое значение результатов исследования. Разработана тестсистема на основе ИФА для выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота. Материалы исследований вошли нормативнотехническую документацию на изготовление набора для серодиагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа ИФА и утвержденную ГУВ Госагропрома СССР в установленном порядке г. Разработаны и утверждены ГУВ Госагропрома СССР Методические указания по серодиагностике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота методом ИФА г. Разработано Временное наставление по применению набора реагентов для серодиагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа ИФА. Проведены межведомственные комиссионные испытания наборов реагентов ИФА акт от г. Опытнопромышленная серия наборов ИФА апробирована в региональных ветеринарных лабораториях, показана их высокая диагностическая ценность. Материалы исследований внедрены в учебный процесс и на их основе разработаны лабораторнопрактические занятия при изучении возбудителей респираторных вирусных инфекций на кафедре ветеринарной вирусологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. Апробация работы. Результаты работы доложены на научнопроизводственных конференциях и конференциях молодых ученых МГАВМиБ им. К.И. Скрябина , на Всесоюзной конференции по молекулярной биологии ДНКсодержащих вирусов, имеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины Киев, г. МГАВМиБ им. К.И. Скрябина г. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе Авторское свидетельство 9 от на способ выращивания вирусоввозбудителей респираторных и кишечных заболеваний крупного рогатого скота.