Конструирование модельных систем для селекции генноинженерных штаммов Bacillus subtilis - продуцентов рибофлавина

• Автор: Ракитин, Андрей Львович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. Оперон биосинтеза рибофлавина

. i ii.

. 1.1 Свойства рибофлавина и его роль в метаболизме организмов.

1.2. Биосинтез рибофлавина у бактерий.

1.3. Структура, организация и регуляция рибофлавинового оперона i ii.

I.4 Клонирование рибофлавинового оперона i

ii в составе рекомбинантных плазмид.

ГЛАВА П. Клонирование ДНК в клетках i ii.

II. 1 Векторы для клонирования ДНК в клетках

i ii.
II. 2. Стабильность плазмид.
.2.1. Структурная нестабильность.
.2.2. Сегрегационная нестабильность.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
ГЛАВА IV. Конструирование гибридных плазмид.
IV. 1.Минимизация фрагмента хромосомы i ii, содержащего в своем составе оперой биосинтеза с рибофлавина.
IV.2.Создание нового поколения векторов для клонирования в клетках i ii.
IV.2.1.Конструирование векторов на основе
низкокопийной плазмиды рМХЗО.
IV.2.2.Конструирование векторов на основе
высококоиийной плазмиды рСВ.
ГУ.3.Клонирование оптимизированного оперона биосинтеза рибофлавина в составе векторов ,
, рСВ и .
ГЛАВА V. Исследование свойств полученных плазмид в клетках
модельного штамма i ii.
V.. Определение уровня биосинтеза рибофлавина .
V.2. Определение уровня стабильности плазмид .
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. .
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Недостаток витамина В2 у животных и человека проявляется в виде поражения кожи, глаз и снижения жизнеспособности. В связи с этим, витамин В2 нашел широкое применение в медицине, сельском хозяйстве, пищевой и фармацевтической промышленности. Вид i ii хорошо изучен и охарактеризован как биохимически, так и генетически. В.ii. Для В. Клетки В. БАВ. Генноинженерные штаммы признаны безопасными в экологическом отношении. Клетки . Поэтому многие штаммы . БАВ ферментов, антибиотиков, аминокислот, пуриновых нуклеозидов, витаминов. Традиционно первый этап создания промышленного штамма продуцента заключался в прямом отборе более продуктивных вариантов после воздействия мутагенов различной природы. Кроме того, отбор новых штаммов происходит эмпирически, неизвестна причина, приведшая к повышению уровня синтеза. Установление биохимических путей биосинтеза того или иного метаболита и генетической регуляции его синтеза позволило проводить направленный отбор штаммов с заданными свойствами. Для этого отбирают штаммы устойчивые к аналогам целевого и промежуточных продуктов, получают направленные мутации ауксотрофности и т. Успешное развитие генетической инженерии позволило многократно увеличивать дозу необходимого генетического материала в клетках штаммапродуцента, что достигается за счет амплификации искомой ДНК в автономном состоянии в составе плазмидных векторов, или интеграции генетического материала в хромосому реципиентного штамма. Для создания современных штаммов продуцентов применяют комбинацию вышеизложенных способов. В настоящее время на основе клеток . В2 Эти штаммы созданы путем соединения традиционных методов селекции с методами современной генетической инженерии. Многие продуценты рибофлавина содержа низкопийную плазмиду рМХ, представляющую собой вектор рМХЗО, несущий рибофлавиновый оперон. Для клонирования ДНК в клетках . Доза генов, клонированных с помощью таких векторов, составляет 13 на геном клетки. Для достижения сверхэкспрессии целевого продукта, теоретически, более предпочтительно использовать многокопийные векторы, т. Но, как правило, в этом случае возникает ряд проблем связанных с различными видами нестабильности гибридных плазмид и отсутствием корреляции между дозой генов и уровнем их экспрессии ,,. В. нашей работе планировали создать модель для изучения влияния копийности плазмид участка вектора в который клонирован рибофлавиновый оперон ориентации целевых генов, встроенных в тот или иной участок вектора дозы целевых генов, т. Поскольку уровень синтеза рибофлавина промышленными штаммами высок, не всегда удается уловить незначительные колебания активности штаммов, содержащих различные плазмиды относительно исходного штамма. Поэтому изучение влияния вышеперечисленных характеристик гибридных плазмид на стабильность штаммов и уровень биосинтеза рибофлавина проводили в модельном штамме . .ii. .ii, содержащего в своем составе оперон биосинтеза рибофлавина. МХЗО. .ii. .ii, размером около Ют. , несущая фрагмент хромосомы . На основе низкокопийного вектора рМХЗО созданы многокопийные векторы рАК8, рАИ, рАН. Показан высокий уровень стабильности полученных векторов в клетках модельного штамма В. МШв. Получены плазмиды рАК1, рАН1, рАИ2, рОК, рБИ, рЬК, рЖ, рАНЕ, рАКВ1, рАИВБ, рАКВ1Е, рАИВБЕ, несущие оперон биосинтеза рибофлавина, клонированный по различным сайтам в различной ориентации. Тем самым создана модель для изучения влияния копийности плазмид участка по которому клонированы целевые гены ориентации рибофлавинового оперона, встроенного в тот или иной участок вектора дозы целевых генов, т. В.виЫШэ и уровень биосинтеза целевого продукта. В2 Для предложенной модели введение инвертированных повторов рибофлавинового оперона является неперспективным. При изучении уровня биосинтеза рибофлавина в клетках модельного штамма В. ЬШвВО АКВБ как в селективных, так и в неселективыых условиях детерминирует биосинтез рибофлавина в 44. МХ, которая составляет основу современных продуцентов рибофлавина.