Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. Streptococcus

• Автор: Белодед, Андрей Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 174 с. : ил.

1.1. История открытия ГК и основные этапы ее изучения.

1.2. Химическое строение и некоторые физикохимические свойства

1.2.1. Пространственная структура ГК. Вторичная и третичная структуры ГК в водных растворах.

1.3. Нахождение и биологические функции ГК у различных организмов.

1.3.1. Наличие ГК у организмов разных таксонов.

1.3.2. ГК в тканях млекопитающих и человека. Функции ГК.

1.3.3. ГК как компонент капсул бактерий.

1.4. Метаболизм ГК.

1.4.1. Биосинтез ГК. Биохимические и генетические аспекты

процесса ферменты, гены, регуляция.

1.4.1.1. Биохимический путь синтеза ГК.

1.4.1.2. Функциональные и кинетические характеристики, локализация, строение и каталитический механизм действия гиалуронатеш пгаз.
1.4.1.3. Характеристика оперона синтеза ГК бактерий
. структура, клонирование и рефляция экспрессии.
1.4.2. Катаболизм ГК у бактерий . .
1.4.2.1. Классификация ферментов, осуществляющих
деполимеризацию ГК.
1.4.2.2. Гиалуронатлиаза бактерий .
функциональные и кинетические характеристики, строение, механизм действия.
1.4.2.3. Биологическая роль гиалуронатлиаз у бактерий
. .
1.5. Получение ГК.
1.5.1. Получение ГК экстракцией из животного сырья.
1.5.2. Получение ГК микробиологическим синтезом.
1.5.2.1. Штам м ы продуценты ГК. 5
1.5.2.2. Среды, условия и режимы культивирования
штаммовпродуцентов ГК.
1.6. Практическое использование ГК.
1.6.1. Медицинское применение 1 К.
1.6.2. Применение ГК в косметологии.
1.7. Заключение.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Материалы.
2.2. Объекты исследования.
2.3. Условия культивирования . ii.
2.4. Условия проведения энзиматической деполимеризации ГК.
2.5. Выделение ГК из КЖ . ii.
2.6. Аналитические методы.
2.6.1. Анализ ГК.
2.6.2. Анализ глюкозы и продуктов метаболизма . ii.
2.6.3.Определение концентрации биомассы . ii.
2.6.4. Электрофорез белков в ПААГ.
2.6.5. Определение молекулярной массы ГК вискозиметрическим методом.
2.7. Микробиологические методы исследований.
2.8. Аппаратурные методы исследований.
2.9. Методы статистической обработки результатов исследования.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 3. Биосинтез ГК культурой . ii.
3.1. Выбор объекта исследования.
3.2. Выбор среды культивирования.
3.3. Кинетика роста и синтеза ГК штаммом . ii В при глубинном культивировании.
3.4. Определение гиалуронидазной активности штамма
. ii В.
3.5. Получение мукоидных штаммов . ii воздействием . УФ.
3.6. Оптимизация состава питательной среды и режимов культивирования . ii КБ.
3.6.1. Оптимизация состава питательной среды методом ПлаккетаБурмана.
3.6.2. Зависимость биосинтеза ГК бактериями . от вида источника углерода и энергии.
3.6.3. Влияние концентрации глюкозы в питательной среде на рост культуры и биосинтез ГК. Определение ингибирующей концентрации глюкозы.
3.6.4. Определение оптимальных значений для синтеза ГК 2 культурой . ii КБ.
3.6.5. Влияние катионов двухвалентных металлов на синтез ГК 4 штаммом . ii КБ.
3.6.6. Влияние аэрации ферментационной среды на синтез ГК
. ii. 1 К как фактор защиты от токсического действия кислорода.
3.6.7. Биосинтез ГК штаммом . ii КБ при
глубинном культивировании с рНстатированием и подпитками по субстрат
3.7. Заключение.
Глава 4. Деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронат
лиазой.
4.1. Выбор объектов исследования.
4.2. Реологические свойства растворов различных образцов ГК.
4.3. Кинетика деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронат 7 лиазой.
4.3.1.Кинетическая схема деполимеризации ГК стрептококковой 7 гиалуронатлиазой.
4.3.2. Вискозиметричсский метод наблюдения за ходом реакции 9 деполимеризации ГК.
4.3.3. Вискозиметрическое определение активности 0 бактериальных гиалуропатлиаз.
4.3.4. Спектрофотометрический метод кинетических 2 исследований расщепления ГК и определение активности стрептококковой гиалуронатлиазы.
4.3.5. Определение продуктов деполимеризации ГК 5 стрептококковой гиалуронатлиазой методом ВЭЖХ.
4.3.6. Инактивация стрептококковой гиалуронатлиазы в ходе
деполимеризации ГК.
4.3.7. Определение оптимальных условий функционирования 0 стрептококковой гиалуронатлиазы.
4.4. Биологическая функция гиалуропатлиаз как ферментов 1 катаболизма ГК, снабжающих бактерии . источником углерода и энергии.
4.5 Получение фракций низкомолекулярной ГК с заданной
молекулярной массой путем энзиматической деполимеризации высокомолекулярной 1 К.
4.6. Определение ГК методом ВЭЖХ по продуктам ее энзиматической 6 деградации стрептококковой гиалуронатлиазой.
4.7. Заключение.
Основные результаты и выводы.
Список использованной литературы


Авторы предположили идентичность выделенного биополимера и ГК, что в дальнейшем полностью подтвердилось. Спустя некоторое время ряд других авторов при работе с разнообразными культурами стрептококков опубликовали похожие данные о выделении ГК , . Стаю очевидно, что этот гликозаминогликан млекопитающих распространен среди некоторых групп стрептококков, многие из которых являются патогенными или условно патогенны для человека и животных. В связи с растущим спросом на ГК, помимо экстракции из животного материала постоянно исследовались вопросы получения ГК микробиологическим синтезом. И в г. ГК осаждением ее из КЖ штамма стрептококка группы А с выходом 0 0 мг на 4 литра среды . Работая с тем же гемолитическим стрептококком, ii и описали упрошенную методику выделения ГК из КЖ, позволившую повысить выход и чистоту продукта . А в г. ГК . На получение, выделение и применение ГК выдано большое количество патентов например, на получение ГК культивированием i Американским патентным бюро выдано более патентов с по гг. ГК, гак и о том, что проблема получения ГК в требуемом объеме не решена до сих лор во всем мире и, в частности, у нас в стране. Это же подтверждают цены на очищенный полисахарид, которые доходят до за 1 кг продукта для сравниния 1 кг полисахарида ксантана, продуцируемого X i, стоит . Ферменты метаболизма ГК начали изучаться с г. Многочисленные исследователи пытались идентифицировать, солюбилизировать, выделить чистый активный фермент, необходимый для синтеза ГК как у стрептококков, так и у эукариотических клеток, или клонировать ген гиалуронатсинтазы в . В г. Активный фермент не образовывался, v i и выделили три мембранных белка стрептококка с молекулярными массами , и кДа и предположили, что белок с массой кДа и есть гиалуронатсинтаза . Дальнейшие исследования показали, что это не так стрептококковая гиалуронатсинтаза является белком с массой кДа по данным электрофоретических исследований. Но все же прорыв в области изучения механизма синтеза ГК и его регуляции вскоре произошел. В г. ГК обнаружен, выделен, охарактеризован и клонирован. Это была первая, успешно клонированная гликозаминогликансинтаза, экспрессия которой была подтверждена образованием ГК у микроорнизма ранее не синтезировавшего данный полисахарид . В настоящее время подходов к изучению ГК и процессов, в которые она вовлечена такое множество, что их невозможно охватить в одном обзоре. Медицинские аспекты включают изучение роли ГК в процессах оплодотворения, эмбриогенеза, выработки иммунного ответа, ранозаживления и в онкологических процессах, в инфекционных заболеваниях, в процессах старения и в проблемах косметической медицины. Ведутся споры о принадлежности ГК и гиалуронатлиазы к факторам патогенности некоторых стрептококков. Изучается строение, вторичная и третичная структуры и динамическая конформация ГК в водных растворах. Взаимодействию ГК с белками, в частности с рецепторами и другими гиаладгеринами, также уделяется существенное внимание. Аналитическая химия рассматривает вопросы определения ГК в различных средах с различным ее содержанием и, в том числе, современными методами ИФА. Продолжаются исследования биокатализа расщепления ГК различными гиалуронидазами. Вопросы биосинтеза ГК как бактериальными ферментами, так и ферментами млекопитающих, переходят из теоретической плоскости осознания механизмов к прикладным задачам по созданию рекомбинантных штаммов и химерных организмов продуцентов ГК с заданными свойствами. ГК. ГК, гиалуронат или гиалуронан термин, обозначающий ГК и ее соли, относится к группе кислых мукополисахаридов или гликозам иногликанов. Почти лет с открытия в г. Мсуег для того, чтобы установить точное химическое строение ГК рис. Молекула ГК построена из ре
СОО
л х Н
Н. ССН

I
гулярно чередующихся остатков Оглюкуроновой кислоты и КацетилИглюкозамина. Аминосахар в молекуле ГК соединен с Оглюкуроновой КИСЛОТОЙ Р гликозидной связью, а глюкуроновая кислота с аминосахаром Р гликозидной связью рис. Рис. Структурная формула молекулы ГК и дисахарида конечного продукта ес расщепления стрептококковой гналуронатлиазой. Связи, атакуемые ферментом.