Разработка тест-системы ИФА для определения кленбутерола в кормах и биологических субстратах

• Автор: Латышев, Олег Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общая характеристика радреностимуляторов

2.2. Метаболизм кленбутерола

2.3. Методы определения Радреностимуляторов

2.4. Скринингметоды

2.5. Иммуноферментный анализ

2.5.1. Гетерогенный иммуноферментный анализ.

2.5.2. Получение иммобилизованных антигенов и антител.

2.5.2.1. Носители, применяемые в ИФА

2.5.2.2. Иммобилизация антигенов
2.5.3. Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Используемые реактивы и материалы
3.2. Методы исследований
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Получение конъюгатов кленбутерола с белками
4.2. Получение специфических иммунных сывороток.
4.3. Отработка условий проведения процедуры НТК ИФА.
4.3.1. Определение активности и специфичности иммунных сывороток
4.3.2. Выбор конъюгата в качестве тврдофазного антигена для сенсибилизации иммунологического планшета.
4.3.3. Выбор оптимальной концентрации твердофазного антигена
4.3.4. Определение оптимального времени сенсибилизации иммунологических планшетов твердофазными антигенами.
4.3.5. Проверка различных иммунологических планшетов в НТК ИФА
4.3.6. Выбор оптимальных условий инкубации антител с твердофазным антигеном в НТК ИФА.
4.3.7. Проверка чувствительности реакции НТК ИФА для определения кленбутерола.
4.3.8. Определение специфичности тестсистемы
4.4. Разработка способов подготовки биологического материала для определения кленбутерола методом ИФА.
4.4.1. Подготовка образцов мышечной ткани и печени.
4.4.2. Подготовка образцов шерсти
4.4.3. Извлечение кленбутерола из сетчатой оболочки глаза
4.4.4. Извлечение кленбутерола из корма
4.4.5. Подготовка образцов мочи
4.4.6. Определение оптимального разведения экстрактов
4.4.7. Определение предела обнаружения.
4.4.8. Комиссионные испытания
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
9. ПРИЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ЛГ антиген
АД адреналин
АТ антитело
БСА бычий сывороточный альбумин
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ГХМС газовая хроматография с массспектрометрией
Ж желатина
ИФА иммуноферментный анализ
КБ кленбутерол
КСА кроличий сывороточный альбумин
НТ ИФА непрямой тврдофазный иммуноферментный анализ
НТК ИФА непрямой тврдофазный конкурентный ИФА
ОФД Офеиилендиамин
ПР перекрестная реактивность
Г1С процент связывания
РИА радиоиммунологический анализ
СБ сальбутамол
ТБ Л тербу талин
ТБМЭ третбутилметиловый эфир
ГМБ 3,3,5,5тетраметилбензидин
ТФА тврдофазный антиген
ТФЭ тврдофазная экстракция
ЯА яичный альбумин
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Такой мониторинг должен основываться на сочетании преимуществ использования экспрессных иммунохичических реакций с достоинствами современных арбитражных спектрометрических методов анализа. Для обеспечения выполнения работ по мониторингу необходимо создание чувствительной и специфичной тестсистемы для быстрого определения КБ и других препаратов этой группы в биологических образцах. Наиболее перспективным является использование иммунохимических методов для скрининга препаратов этой группы, поскольку такие методы обладают высокой чувствительностью, простотой проведения анализа, низкой себестоимостью, и позволяют проводить анализ большого количества образцов за короткий промежуток времени ,, , . Целью нашей работы являлось создание чувствительной и специфичной тестсистемы для контроля за применением КБ в качестве стимулятора роста на стадии выращивания животных и определения его остаточного содержания в продукции животноводства экспрессметодом ИФА. Получить иммунореагенты конъюгаты КБ с высокомолекулярными белкаминосителями и специфические антитела для определения КБ иммунохимическим методом. ИФА НТК ИФЛ для определения КБ в биологическом материале. Определить чувствительность и специфичность метода. Разработать простые и эффективные способы подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА. КБ в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных обосновать выбор биосубстратов для контроля за применением КБ на стадии выращивания животных, а также определения его остаточного содержания в продукции животного происхождения. Провести комиссионные испытания разработанной тестсистемы. Разработать нормативную документацию и зарегистрировать в РФ тестсистему для определения КБ в кормах и биологических субстратах методом ИФА. Впервые в Российской Федерации получены высокоспецифичные иммунореагенты конъюгаты КБ с белкаминисителями и специфические антитела. На основе полученных иммунореагентов создана чувствительная и специфичная тестсистема, для обнаружения КБ в биологических субстратах на основе НТК ИФА. Разработаны простые и экономичные методы экстракции КБ из кормов, биологических жидкостей, органов и тканей животных, позволяющие не применять дополнительную очистку экстрактов методом тврдофазной экстракции ТФЭ и обеспечивающие высокую чувствительность определения КБ методом ИФЛ. Основываясь на данных по фармакокинетике КБ в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных, обоснован выбор органов и тканей для эффективного контроля за применением КБ в животноводстве. Впервые в Российской Федерации создана тестсистема для определения КБ в кормах, биологических жидкостях, органах и тканях животных методом НТК ИФЛ. Тестсистема позволяет определять не только кленбутерол, но и Радреностимуляторы фенольного сальбутамол и резорцинового тербуталин типа. Па тестсистему утверждена нормативная документация. Тестсистема зарегистрирована в РФ и налажено серийное производство наборов для выявления КБ в биологических образцах методом ИФА. Московском международном ветеринарном конгрессе Москва, . Общества биотехнологов России Москва, . Международной конференции Экстракция органических соединений Воронеж, . XIV Всероссийского ветеринарного конгресса Москва, . Международном конгрессе по аналитической химии 1САБ Москва, . Получение специфических иммунореагентов и подбор, на их основе, оптимальных условий проведения НТК ИФА для определения КБ. Разработка простых и эффективных способов подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА. Результаты комиссионных испытаний разработанной тестсистемы. По теме диссертации опубликовано печатных работ в различных изданиях с изложением основных положений и выводов диссертационной работы, в том числе в ведущих научных журналах и изданиях. Диссертация изложена на 1 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение рсзул Работа иллюстрирована 7 рисунками и таблицами. Список литературы содержит 7 источников, в том числе 9 иностранных.