Регенерация и трансформация ремонтантных форм малины

• Автор: Соболева, Анна Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. Литературный обзор по проблеме исследований

1.1. Методы получения трансформированных растений.

1.2. Краткая характеристика агробактериальных векторных систем

1.2.1. Структурно функциональная организация Т плазмид

1.2.2. Методы агробактериальной трансформации растений

1.3. Методы прямого переноса генов в растения

1.4. Селекция трансформированных тканей растений

1.5. Экспрессия чужеродных генов и ее регуляция в трансгенных растениях

1.6.1. Регенерация растений плодовых культур
1.6.2. Агробактериальная трансформация растений плодовых культур
1.7. 1. Регенерация растений рода ЯиЬиз
1.7. 2. Трансформация растений рода иЬия с помощью i ШтеасепБ
1.8. Генетическая стабильность регенерирующих побегов
ГЛАВА II. Методика и условия исследований
2.1. Характеристика объекта исследований
2.2. Методика трансформации табака
2.3 Строение используемых генетических конструкций
2.4. Методика получения регенсрантов ремонтантной малины
2.5. Агробактериальная трансформация листовых эксплантов ремонтантной малины
2.6 Методика выделения ДНК малины
2.7. Методика выделения плазмидной ДНК из агробактерии
2.8 Условия проведения полимеразной цепной реакции для анализа полученных регенерантов
2.9. Методика постановки чашечного теста для определения экспрессии гена лихеназы
2. Методика выделения ДНК и РНК малины
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Разработка условий регенерации на листовых эксплантах ремонтантной малины
3.2. Изучение генетической однородности полученных регенерантов ремонтантной малины
3.3. Разработка метода трансформации ремонтантной малины
3.3.1.Освоение методики трансформации на табаке
3.3.2. Подбор оптимальных условий агробактириальной трансформации
ремонтантной малины
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выводы и практические рекомендации
Список использованной литературы


Элементы системы трансформации малины, которая включает способ инокуляции А. ШтеааепБ и повышение степени регенерации с помощью абсцизовой кислоты АБК, подходы для селекции трансформантов и их анализа. Получение трансформантов ремонтантной малины, содержащих экспрессирующиеся репортерные гены термостабильной бактериальной лихеназы, а также гены устойчивости к антибиотику канамицину прШ. В ходе проведенных исследований было показано, что с учетом оптимизации влияния внешних условий и физиологического состояния эксплантов, выбора оптимальных концентраций фитогормонов, в присутствии в качестве цитокинина возможна регенерация практически всех изученных генотипов малины, несмотря на их сложное гибридное происхождение с участием межвидовой гибридизации. Между тем, в ряде публикаций отмечалось, что к регенерации способны только некоторые генотипы. Результаты данной работы позволяют заключить, что практически все генотипы малины обладают способностью к регенерации, хотя и в различной степени. Требуется только подобрать условия для е проявления. Разработка такой системы регенерации имеет не только научное, но и практическое значение. Поскольку показано отсутствие значительного уровня генетических изменений при регенерации побегов на листовых эксплантах, этот процесс может быть использован в качестве вспомогательного метода для ускоренного размножения некоторых образцов, при обязательном контроле генетической стабильности, особенно для каждой новой формы. Кроме того, разработка стабильной и высокоэффективной системы регенерации является необходимым этапом для применения к малине методов генетической инженерии. Получены трансгенные растения ремонтантной малины с селективными и репортерными генами. Введение последних, в частности гена, кодирующего термостабильную бактериальную лихеназу, позволяет при массовом получении регенерантов на начальных этапах их отбора и изучения обходиться без сложных молекулярнобиологических методов. Использование методов генетической инженерии занимает важное место в современных подходах физиологии растений. Малина вообще и ремонтантная малина в особенности очень плохо изучены в физиологическом отношении. Освоение методов получения трансгенных растений малины открывает возможность изучать функции, строение и регуляцию экспрессии отдельных генов, организацию генома, модифицировать активность генов с помощью технологии антисмысловых нуклеиновых кислот и т. Вместе с тем, получение трансгенных растений малины может иметь также практическое значение для повышения продуктивности и улучшения качества продукции, повышения устойчивости к болезням, применения более эффективных и экологически безопасных гербицидов и т. Таким образом, можно заключить, что полученные результаты имеют существенное научное значение, а также практическую ценность для разработки новых методов производства посадочного материала ремонтантной малины и селекции новых сортов. Данные, представленные в диссертационной работе, используются в курсе лекций и для практических занятий по биотехнологии в Брянской государственной сельскохозяйственной академии. ГЛАВА I. Создание трансгенных форм культурных растений с заданными характеристиками требует разработки методов трансформации применительно к изучаемой культуре и используемым сортам. В настоящее время применяются две основные группы методов переноса чужеродных ДНК в клетки растений. В методах первой группы используются векторные системы на основе ТДНК агробактсриальных Т плазмид. Сдерживающим фактором при использовании методов этой группы является ограниченный круг хозяев агробактерии Лутова Л. А., . Вторая группа методов использует различные приемы прямого переноса ДНК в растительную клетку, в частности, микроинъекции, электропорацию, биолистику и их различные вариации. Для второй группы методов нет ограничений в таксономическом положении растений, однако большинство из них сопряжено с использованием изолированных протопластов растений, что не всегда удобно при получении регенерантов растений i . . . . . . . . .