Экспрессия рекомбинантных белков в молоке трансгенных коз и овец

• Автор: Гвоздь, Инна Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Дубровицы
• Количество страниц: 113 с. : ил

Содержание
Введение

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Генноинженерные технологии новый путь развития животноводства.

1.2 Методы получения трансгенных животных

1.3 Ретровирусы как векторы для переноса экзогенных генов

1.3.1. Жизненный цикл и строение ретровирусов.

1.3.2. Ретровирусные векторы.

1.4 Экспрессия чужеродных генов в молочной железе трансгенных животных.

1.4.1. Производство рекомбинантных белков.

1.4.2. Химозин.

1.4.3. Эритролоэтин биология, функции, методы получения.
1.4.4. Биология, функции, получение и применение гранулоцигарного колониестимулирующего фактора ГКСФ.
1.5. Выбор вида животныхпродуцеитов биологически активных веществ.
1.5.1. Козы как продуценты рекомбинантных белков.
1.6. Заключение.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Реактивы и оборудование
2.2. Получение соматических трансгенных животных.
2.3. Подготовка и отбор проб молока у трансгенных коз и овец
2.4. Методика эстракции ДНК из молока.
2.5. Анализ животных на наличие рекомбинантной вставки
2.6. Методика определения экспрессии эртропоэтина человека с помощью моноклональных антител.
2.6.1. Иммуноферментный анализ
2.6.2. Определение рекомбинантного 1 КСФ в молоке
2.7. Методика определения экспрессии химозина в молоке трансгенных овец.
2.8. Методика приготовления гистологических препаратов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Оценка клетокупаковщиц на наличие
рекомбинантной вставки
3.2. Получение соматических трансгенных животных.
3.2.1. Эффективность трансформации клеток молочной
железы коз ретровирусными генными конструкциями.
3.2.1.1. Анализ интеграции генных конструкций рЬИос и рЬИ 0С8Е.
3.2.2.2. Исследование экспрессии рекомбинантного
эритропоэтина к молоке коз.
3.2.2.3. Исследование экспрессии рекомбинантного
гранулоцитарного колониестимулирующего фактора
в молоке коз.
3.3. Сравнительный анализ эффективности
трансформации молочной железы коз генными конструкциями рЬЫа и р,Ы0С8Р.
3.3.1. Влияние периода лактации на уровень экспрессии
рекомбинантных белков.
3.3.2. Влияние стадии введения клетокупаковщиц на
уровень экспрессии рекомбинантных белков.
3.3.3. Влияние генной конструкции на уровень экспрессии
рекомбинантных белков.
3.4. Сравнительное исследование гистоструктуры вымени
3.5 Изучение биологических особенностей овцематок,
трансгенных по генной конструкции альфаБIказеин химозин.
3.5.1. Исследование молочной продуктивности и свойств
молока трансгенных овец.
3.5.2. Исследование активности химозина в молоке
трансгенных овец.
3.5.3. Исследование структуры вымени трансгенных
овцематок посредством электронной микроскопии.
3.5.4. Гистологические исследования структуры вымени
трансгенных овцематок.
3.5.5. Изучение биологических особенностей при
индуцированной лактации.
3 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ
ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Установлен уровень и характер синтеза рекомбинантных белков в молоке трансгенных коз в ходе лактации. Выявлены факторы, влияющие на эффективность получения соматических трансгенных коз. Изучена молочная продуктивность и активность химозина в молоке трансгенных овец при нормальной и индуцированной лактации. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых ВИЖа на международной научной конференции Актуальные проблемы ДНКтехнологий и клеточной инженерии сельскохозяйственных животных на конференциях отдела биотехнологии ВИЖа , . Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 3 страницах, содержит таблиц и рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка литературы, который включает 6 источников. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Выделение биотехнологии и генетической инженерии в самостоятельные направления качественно новый этап развития биологической науки. До последнего времени задача животноводческой науки сводилась к максимальной реализации полезных качеств, присущих живому организму. Использование методов биотехнологии позволяет расширить пределы естественных возможностей организма на основе знаний фундаментальных процессов жизнедеятельности и управления ими Эрнст Л. К. . Среди новейших достижений биотехнологической науки, привлекающих пристальное внимание ученых всего мира, одно из первых мест занимает изменение генома эукариот в том числе сельскохозяйственных животных, с целью придания им определенных хозяйственнополезных признаков методами генетической инженерии i . ., . Были созданы методы, позволяющие выделять отдельные гены или синтезировать их, а также интегрировать чужеродные гены в геном реципиента. Гены могут пересаживаться в геном организма другого вида, рода, семейства, типа. Например, гены ингерферонов животных успешно пересажены в геном растений и оказывают положительное действие, делая трансгенные растения болсс устойчивыми к вирусам Брем . Включение чужеродных последовательностей ДНК в геном организма с последующей устойчивой, их наследуемостью в ряде поколений обеспечивает получение трансгенных животных. При этом для интеграции генов не существует никакого видового барьера. Гольдман И. Л . В случае успеха можно ожидать изменения фенотипа на уровне целого организма и наследования трансформированного признака потомками. Пересадка генов и генных конструкций, связанных с механизмами регулирования обмена веществ в организме, роста, лактации, воспроизводства, яйценоскости. Улучшение показателей роста. Путем переноса гена гормона роста предпринимаются попытки повысить продуктивность и улучшить качество продукции у сельскохозяйственных животных РиГБе1 У. С. еБа1 . Воздействие на качество продуктов животноводства. Улучшение переваримости питательных веществ кормов и их использования для формирования продукции. Получение биологически активных веществ, главным образом, белков, часто совершенно отсутствующих у интактных животных. Развитие этого направления связано с возможностью создания таких генных конструкций, которые при интеграции способны обеспечивать экспрессию только в определенных органах и тканях, например, в секреторных клетках вымени, других желез внешней секреции. Получение животных с повышенной устойчивостью к заболеваниям, что достигается, прежде всего, за счет интщрации в геном генов антисмысловых РНК ряда вирусов. Действие этих конструкций ингибирует воспроизводство в организме определенных вирусов. Перспективна и пересадка генов интерферонов, которые позволяют усилить устойчивость организма к широкому спектру вирусных болезней Брем . Использование траисгенных животных в качестве биомоделей в медицине. Перспективным направлением может оказа ться использование для ксенотрансплантации органов и тканей трансгенных животных, несущих специальные генные конструкции.