Научно-методические аспекты приготовления и использования магнитоуправляемых иммобилизованных микробиологических систем

• Автор: Владимцева, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Волгоград
• Количество страниц: 304 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Типы магнитных носителей, применяемых для иммобилизации биомолекул и клеток.

1.2. Методы иммобилизации биологических объектов на магнитные носители

1.3. Направления технологического использования магнитных носителей биомолекул и клеток.

1.3.1. Твердофазный иммуноанализ бактериальных антигенов и антител . .

1.3.1.1. Иммунофлуоресцснтные методы анализа

1.3.1.2. Иммуноферментные методы анализа

1.3.1.3. Радноиммунные методы анализа.

I 3.1.4. Использование липосом в иммуноанализе

1.3.2. Магнитоуправляемое выделение биомолекул и клеток.

1.3.3. Биотехнологическое получение биомассы и метаболитов
микроорганизмов с помощью магнитных носителей.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1 .Штаммы, питательные среды, культивирование микроорганизмов
2.2. Получение антигенов и антител. Биологические и иммунологические методы
2.3. Физикохимические и биохимические методы.
2.4. Диагностические методы.
2.5. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БИОМОЛЕКУЛ В ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ИНДИКАЦИОННЫХ ТЕСТ
СИСТЕМАХ
3.1. Изучение возможностей иммунофлуорссцентной ОАББсистемы.
3.2. Исследование особенностей применения иммуномагнитной технологии дя определения биомолекул и клеток.
3.3. Оценка иммунохимичсской активности иммобилизованных в носители лигандов
3.4. Разработка эффективного способа иммобилизации биомолекул на твердофазные микрогранулированные носители
3.5. Применение иммобилизованных систем для индикации бактериальных антигенов в сточных водах предприятия микробиологического профиля .
3.6. Использование моноклональных иммуноглобулинов дя получения магнитных сорбентов.
3 7 Конструирование твердофазной иммунодиагностической тестсистемы
на основе люминесцирующих липосом.
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ БИОТЕХНОЛОГИ ЧЕСКОЮ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОБИОЛО ИЧЕСКИХ СИСТЕМ
4.1. Разработка технологии глубинного культивирования псевдомонад и их метаболитов.
4.2. Усовершенствование технологических параметров получения микроорганизмов рода i.
4.3. Использование магнитоуправляемых иммобилизованных систем для
глубинного культивирования микроорганизмов
4.3.1 Оптимизация условий иммобилизации живых бактериальных клеток в магнитные носители
4 3 2 Глубинное культивирование микроорганизмов, иммобилизованных в магнитные носители
4.3.3. Влияние электромагнитного поля на жизнедеятельность микробных
клеток при их глубинном выращивании
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ НОЛЕЙ ПА МИКРООРГАНИЗМЫ АКТИВНОГО ИЛА СООРУЖЕНИЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ.
5.1. Исследование воздействия электромагнитного поля на микроорганизмы активного ила.
5.2. Изучение влияния ионизированною воздуха на бактерии очистных сооружений
5.3. Расчет на ЭВМ промышленного аэротенка городских очистных сооружений
5.4. Расчет промышленного высоконагруженного биофильтра городских
очистных сооружений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БГЖ биохимический показатель кислорода
ЗФР забуференный физиологический раствор
КМI карбоксиметилцеллюлоза
ЛИЛ липосомный иммунный анализ
М.к. микробные клетки
МС магнитный сорбент
МФА метод флуоресцирующих антител
ОСО оптический стандарт мутности
ПААГ полиакриламидный гель
РИА радиоактивный иммунный анализ
РИД реакция иммунодиффузии в геле
РИГА реакция непрямой гемагглютинации
ТИЛМ твердофазный иммунофлуоресцснгный липосомальный метод
ТОМФ триоксиметилфосфин
ФБР фосфагный буферный раствор
ФМС фосфиновый магнитный сорбент
ФI фосфоцеллюлоза
ЭМП электромагнитное поле
ВВЕДЕНИЕ


Сравнительные эксперименты показали, что ковалентная иммобилизация за счет прочности связи во многих случаях является более предпочтительной, чем физическая адсорбция , 2 При этом важно, чтобы активные центры биомолекул, необходимые для проявления специфической активности, не участвовали в ковалентном связывании с носителем. Существует классификация методов ковалентного связывания по типу химических связей, образующихся в результате ковалентного взаимодействия ингредиентов связывания . В данном обзоре рассмотрены лишь основные методические приемы ковалентной иммобилизации, наиболее часто используемые в биотехнологии. С целью ковалентной иммобилизации носитель необходимо предварительно активировать, чтобы появилась возможность его химического связывания с биологическим объектом Одним из доступных методов ковалентной иммобилизации представляется связывание биополимеров с сефарозой, активированной бром цианом. Этот носитель является коммерческим препаратом и иммобилизацию на нем можно проводить, минуя стадию предварительной активации. Однако отечественная промышленность не выпускает указанный препарат, кроме того, введение магнитного материала в коммерческий носи гель сопряжено с определенными трудностями. Наиболее широко распространен метод ковалентной иммобилизации с использованием в качестве сшивающего агента глутарового альдегида. Разработаны методики присоединения биомолекул к различным магнитным носителям желатине 9. В литературе встречаются сообщения об использовании глутарового альдегида дл я ковалентной иммобилизации бактериальных клеток 1,9,5,0. ДеапЛ1 . Авторы установили, что такая обработка инициирует повреждения цитоплазматических мембран и метаболической системы микроорганизмов. Связывание белковых молекул с магнитными носителями возможно с помощью карбодиимида. Предложены методики карбодиимидиой ковалентной иммобилизации биомолекул с полистиролом 1, латексом 0, кремнийор эпическими ферромагнитными частицами 4. X и другими носителями. Опубликована работа, содержащая методику иммобилизации эукариотических клеток на немагнитный носитель с использованием карбодиимида 9 Эффективным методом ковалентной иммобилизации биополимеров, по мнению ряда авторов, является активирование носителя перйодатом натрия 3,3,8,8,4,7. В качестве носителей в данных методиках могут использоваться железосодержащие бногелн 3, магнитные дскстрановые частицы 7, намагниченные целлюлозные гранулы 8, дериваты полиэтнленгликоля, содержащие магнетит 4. М. 9 предложил технику периодатного окисления полисахаридов клеточных стенок Образующиеся при этом альдегидные группы взаимодействуют с аминогруппами иеллюлозных носителей Кроме того, активированные клетки дрожжей были способны связывать и ферменты, что повышает удельную ферментативную активность катализатора в биотехнологических процессах. Указанная технология открывает возможности получения гетерогенных бнокатач изаторов с различной ферментативной активностью. В качестве спенсеров для ковалентной иммобилизации может быть использован целый ряд других химических агентов, например, нитрофенилцианат 4, цнанобор гидрат 2, маленмид 3, полиметил метакрилат 5, вещества, содержащие различные эпокси и карбоксигруппы 0. Особое значение при ковалентной иммобилизации биологических агентов имеет длина сшивающего агента. В то же время увеличение расстояния приводит к снижению устойчивости лиганда к различным воздействиям по сравнению с жестко фиксированной его формой. Простым и доступным способом иммобилизации, не требующим дополнительном модификации носителя, считается металлохелатный метод. Он основан па свойстве переходных металлов образовывать хелатные комплексы. Имеется широкий выбор переходных металлов, но наиболее подходящими для данного случая свойствами обладают титан и цирконий, оксиды которых не токсичны 2. В качестве носителя при иммобилизации биомолекул посредством переходных металлов могут использова1Ься силикагель 2,, бактериальные клетки 5, це. Описан металлохелатный метод иммобилизации живых микробных клеток . Е.соН 2 на носигелях, активированных ионами переходных металлов гидроокиси титана и цинка.