Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка

• Автор: Коржикова, Светлана Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Дубровицы
• Количество страниц: 119 с. : ил

Содержание

I1ИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕМ 1ИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Стволовые клетки сперматогонии у млекопитающих

1.2. Пролиферация и дифференцировка сперматогоний типа А.

1.3. Факторы, стимулирующие пролиферацию и дифференцировку сперматогоний

1.4. Сперматогенез у различных видов млекопитающих

1.5. Выделение стволовых клеток сперматогоний млекопитающих и культивирование i vi

1.6. Трансплантация СКС

1.7. Заключение

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. од I ото в ка ж и ы х
2.2. Приборы и оборудование
2.3. Культуральные среды, растворы и реактивы
2.3.1. Ростовые среды
2.3.2. Специальные среды и растворы
2.4. Культуральная посуда
2.5. Приготовление фидерных слоев для культивирования СКС
2.5.1. Культивирование фибробластов и перевиваемых клеток Сертоли свиней
2.5.2. Получение первичных клеток Сертоли свиней и их
культивирование
2.5.3. Субкультивирование клеток
2.5.4. Подавление пролиферативной активности клеток
фидерных слоев
2.6. Выделение культур клеток из семенника самца свиньи
2.6.1. Механический метод выделения
2.6.2. Ферментативный метод выделения
2.6.3. Очистка стволовых клеток сперматогоний типа А от
других клеточных типов семенника
2.7. Идентификация стволовых клеток сперматогоний типа А свиньи т
2.7.1. Идентификация СКС в образцах фиксированных тканей
2.7.2. Идентификация СКС в культуре
2.8. Введение молекул экзогенной Д1 ПС в клетки Сертоли свиньи, БТОфибробласты и культуры клеток, выделенные из семенников самца свиньи
2.8.1. Происхождение рекомбинантной конструкции,
используемой в экспериментах
2.8.2. Приготовление ДНК
2.8.3. Введение экзогенной ДНК электрическим пробоем
2.8.4. Выявление продукта экспрессии бетагапактозидазы в
трансфе щроваиных клетках
2.9. Трансплантация стволовых клеток сперматогоний типа А
свиней в семенники стерильных реципиентов
2.9.1. Формирование экспериментальных групп животных
2.9.2. Выключение сперматогенеза у животныхреципиентов
2.9.3. Получение культур клеток из семенников донора
2.9.4. Введение клеток донора в семенники животных
реципиентов
2.9.5. Анализ эффективности возобновления сперматогенеза у
реципиен тов клетками донора
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Изучение динамики сперматогенеза и характеристика клеточных типов семенника свиньи в образцах фиксированных тканей.
3.2. Влияние возраста хрячков на получение обогащенной культуры С КС.
3.2.1. Определение оптимального возраста хрячков для
получения обогащенной культуры СКС на основе анализа образцов фиксированных тканей.
3.3. Выделение СКС из семенников самцов свиней
3.3.1. Сравнительный анализ эффективности механического и ферментативного способов выделения культур клеток из семенников свиней
3.3.2. Очистка СКС от других клеточных типов семенника.
3.4. Характеристика клеточных типов семенника в культуре
3.5. Культивирование СКС
3.5.1. Влияние различных монослоев соматических клеток на
поддержание СКС в культуре.
3.5.2. Влияние ростовых факторов на культивирование СКС
3.6. Сравнительный анализ компетентности различных типов клеток к поглощению рекомбинантной ДНК
3.7. Обработка животныхреципиентов бусульфаном с целью выключения их собственного сперматогенеза
3.7.1. Влияние кратности обработок бусульфаном на
дегенерацию стволовых клеток сперматогоний типа А
3.7.2. Влияние обработок бусульфаном па физическое состояние
животныхреципиентов
3.8. Введение донорских СКС типа А свиньи в семенники животныхреципиентов
3.9. Анализ эффективности трансплантации донорских клеток
3Исследование динамики экзогенного сперматогенеза у животныхреципиентов
4. ОБСУЖДЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Стволовые клетки, обладающие неограниченными потенциями к цитодифференцировке, способные реализовать генетическую информацию ядер клеток, обеспечивая их дифференцировку, а также развитие до целого организма называют юти потентными . Единственным источником потенциально тотипотентных диплоидных клеток во взрослом организме млекопитающих являются стволовые клетки сперматогонии СКС. Уникальное свойство стволовых клеток сперматогоний многократно самообновляться открывает широкие возможности реализации потенциала этих клеток в создании новых видов животных с измененным геномом. У половозрелых самцов популяция диплоидных стволовых клеток сперматогоний постоянно обновляется и производит потомство клеток, которое инициирует комплексный процесс дифференцировки, приводящий к появлению высоко специализированных половых клеток сперматозоидов. Теоретически одна сперматогониальная стволовая клетка способна сформировать сперматид . После оплодотворения, дополненные женскими гомологами, сперматозоиды участвуют в эмбриогенезе, и в итоге, в дифференцировке каждой клетки организма. В этом случае стволовые клетки сперматогонии могут считаться тотипотентньгми. И хотя женские ооциты, имеющиеся у половозрелых особей, и принимают генетическое участие в создании потомства, они не являются самообновляющимися при рождении их имеется конечное количество, которое постоянно уменьшается в течение жизни самки. В настоящее время ряд ученых из ведущих научноисследовательских институтов мира занимаются изучением различных аспектов, связанных с выделением, культивированием, генетической трансформацией, трансплантацией стволовых клеток сперматогоний млекопи тающих, в том числе сельскохозяйственных животных и человека ,,,3. Актуальность этих исследований заключается в том, что наряду с теоретическими изысканиями поднимаются такие важные практические задачи, как лечение бесплодия например, после курсов химио и радиотерапии при лечении рака, регулирование рождаемости у людей, получение животных с улучшенными полезнохозяйственными признаками и др. Пролиферация и дифференцировка сперматогоний являются комплексным процессом, который включает в себя многие регуляторные факторы и межклеточные взаимодействия, что создает большие трудности в изучении этих сложных процессов i viv. В связи с этим выделение СКТ из тестикул млекопитающих, манипуляции с ними i vi и пересадка их в семенники реципиента открывают новые возможности в изучении сперматогенеза и проведении геномных манипуляций у млекопитающих, и представляют собой одно из перспективных направлений в клеточной биологии. Ядра стволовых клеток являются ценным материалом для конструирования новых клеточных типов в процессе клонирования. Исследования по клонированию животных путем пересадки ядер развиваются очень интенсивно. При этом исходным материалом служили 4х клеточные эмбрионы. В настоящее время ведутся успешные попытки использования ГТГК в качестве доноров ядер. Так, в США в году впервые удалось получить клонированного теленка по кличке Ген 8. Исходным материалом для клонирования послужили ядра ГГПЗК крупного рогатого скота, полученные из закладок гонад плода теленка в возрасте суток. Сперматогениыс клетки спер. А вполне могут служить источником ядер для реконструирования зигот с целью получения животных с заведомо известными признаками. Первой попыткой использования сперматогоний в качестве источника ядер для трансплантации в энуклеированную клетку, с целью определения их потенций, являются исследования, проведенные на лягушках . На человеческих яйцеклетках показано развитие до стадии морулы после часов культивирования реконструированных клеток, полученных путем трансплантации сперматогоний в энуклеированные созревшие ооциты на стадии метафазы 0. СКС потенциальная тотипотентность дает возможность клонирования самцов млекопитающих с помощью трансплантации ядер сперматогоний, полученных из тестикул 3,2. Очень перспективный подход для получения трансгенных животных посредством использования мужских стволовых клеток был предложен Бринстером и Авербаком . Они разработали технику, с помощью которой возможна трансплантация клеток, выделенных из семенника донора, в мышиные семенные канальцы стерильных самцов реципиентов.