Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина

• Автор: Франк, Людмила Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 225 с. : ил.

1.1. Получение и очистка рекомбинантных Са2регулируемых фото протеино в

1.2.Получение биоспецифичных производных рекомбинантных фотопротеинов, пригодных для использования в качестве меток в микроанализе i vi

1.2.1. Химический синтез коныогатов.

1.2.2. Получение бифункциональных химерных белков акворин биоспецифичный полипептид.

1.3. Биолюминесцентный молекулярный микроанализ с использованием акворина в качестве репортерного белка .
1.3.1. Биолюминесцентный иммуноанализ с использованием акворина как репортерного белка

1.3.2. ДНКгибридизационный анализ с использованием акворина в

качестве репортерного белка

ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3.ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА.

3.1. Экстракция апообелина из рекомбинантных клеток . i этапы

3.2. Очистка апообелина ионообменной хроматографией в денатурирующих условиях этап 4.
3.3. Активация апообелина целентеразином. этап
3.3.1. Влияние природы восстановителя и его конценграции на эффективность активации апообелина
3.3.2. Зависимость эффективности активации остаточной концентрации мочевины.
3.3.3. Зависимость эффективности активации от активационного буфера.
3.3.4. Зависимость эффективности активации от концентрации апобелка
3.3.5. Кинетика активации
3.4. Очистка обелина ионообменной хроматографией этап
3.5. Основные физикохимические свойства рекомбинантного
обелина
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ БИОСПЕЦИФИЧНЫХ КОНЪЮГАТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
В КАЧЕСТВЕ МЕТОК В МОЛЕКУЛЯРНОМ АНАЛИЗЕ
4.1. Получение биоспецифичных коньюгатов обелина химическими
методами.
4.1.1 Синтез биотинилированных производных.
4.1.2. Синтез коньгатов с другими гаптенами и с белками
4.2. Получение коньюгатов обелина в виде генетических химер
4.2.1. Биотинилирование обелина i viv.
4.2.2. Получение химерного белка
ГЛАВА 5. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ИММУ НО АНАЛИЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЬЮГАТОВ ОБЕЛИНА В КАЧЕСТВЕ МЕТКИ
5.1. Биолюминесцентный иммуноанализ альфафетоиротеина АФП
5.2. Биолюминесцентный иммуноанализ тиреотропина ТТГ и двух форм
тироксинаобщего ТТ4 и свободного
Биолюминесцентный иммуноанализ инфекционных агентов
5.4 Биолюминесцентный иммуноанализ антител к туберкулезному токсину. . Л
5.5. Одновременный биолюминесцентный. иммуноанализ двух антигенов водном образце с ипользованием мутантных вариантов обелина с измененными спектрами биолюминесценции 6 .
5.6. Биолюминесцентный иммуноанализ двух антигенов в одном образце с ипользованием обелина в тандеме с целентеразинзависимой люциферазой
ii
5.6.1. Выделение, очистка и некоторые физикохимические свойства целентеразинзависимой рекомбинантной люциферазы ii
5.6.2. Биотинилирование и использование полученных производных в твердофазном микроанализе двух антигенов в одном образце в тандеме с
обелином
ГЛАВА 6. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА.
6.1. Твердофазный гибридизационный анализ в модельных системах
6.1.1. Анализ на мелкодисперсном полимере ДМЭГ
6.1.2. Анализ на поверхности микропланшет.
6.2. Анализ продуктов ПЦР гена вируса гепатита С
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


С одной стороны, это существенным образом упрощает выделение целевого белка, поскольку в тельцах включений он находится практическив индивидуальном состоянии и легко отделяется от пула растворимых клеточных белков простым центрифугированием. Однако полученные при этом белки не обладают природными биологически активными конформациями. Особенно остро это проявилось при экспрессии белков, богатых цистеиновыми остатками, которые в своей активной природной конформации содержат в составе молекул один или несколько цистеиновых мостиков. Несмотря на то, что к настоящему времени накоплен огромный опыт по проведению фолдинга рекомбинантных белков, экспрессируемых в виде телец включений см. Поэтому в настоящее время для получения рекомбинантных эукариотических белков активно разрабатываются системы экспрессии на основе дрожжевых, инсекгных и др. Экспрессия в эукариотических клетках особенно ценна в случае когда речь идет о получении белков, специфическая активность которых связана с постэкспрсссионной модификацией например, гликозилированием см. Другой часто используемый подход это конструирование экспрессирующей системы, в которой целевой белок соединен в одну полипептидую последовательность фыожинбелки с полипептидами, обеспечивающими их большую растворимость, например, мальтозасвязывающий белок i С. А из I . Часто такая экспрессия проводится при пониженной температуре инкубирования, бактериальных клетокхозяев. Если необходимо удаление вспомогательного полипептида, то в последовательность, фьюжинбелка вводят специфические сайты редких энтеропептидаз, которые обеспечивают отщепление вспомогательных фрагментов. Рис Конструирование, выделение и использование генетически слитых фьюжин белков. Как правило, вспомогательные белки, входящие в состав фьюжинконструкций, выполняют еще одну важную роль они существенным образом облегчают выделение и очистку целевых белков, обладая специфической биологической аффинностью к иммобилизованным молекулам Рис. Последний вариант является особенно эффективным подходом па данный момент на современном биотехнологическом рынке предлагаются готовые векторы для экспрессии i меченых рекомбинантных белков и металлаффинные сорбенты, например, i i, или сорбент на основе ионов Со2 , , США. В литературе описано использование такого подхода и для выделения рекомбинантных апофотопротеинов с помощью i фрагмента выделена одна из изоформ клитина I . К. . I . Как правило, эти химерные фотопротеи новые белки использовались не только для быстрой и эффективной очистки, но и как готовые конструкции для последующего применения в качестве репортеров в микроанализе. Этот аспект будет нами рассмотрен далее в разделе 1. В литературе фотопротеины часто называют предварительнозаряженными молекулами ii . Еще при исследованшьприродного акворина было показано i О. Работы по установлению структуры молекулысубстрата вбиолюминесцентных системах кишечнополостных проводилисьодновременно. О. Шимомурой при исследовании биолюминесценции медузы vii и М. Кормиером при изучении биолюминесцентной системы мягкого коралла i ii в конце х начале х годов. История этих работ, а также работ по получению синтетического субстрата подробно описаны в ряде обзоров см. К. . Вначале была установлена структура продукта реакции. Дело в том, что после биолюминесцентной реакции акворина, инициируемой ионами кальция, полученный белок голубой флуоресцентный белок i О. Т.е. Молекулу хромофора отделили с помощью гельфильтрации и установили его структуру 2п гпдроксифеиилацетамид3бензил5пгидроксифенил пиразин i О. По аналогии с частично установленной к тому времени структурой субстрата ii iii Шимомура установил, что субстратом акворина является соответствующий имидазолпиразин i О. Результаты, полученные М. Кормиером с коллегами, также указывали на наличие имидазолпиразинового фрагмента, аналогичного аквориновому в структуре люциферина i i . Позднее в работе i К. Обратив внимание на распространенность имидазолпиразинонов в биолюминесцентных системах целентерат к тому времени были опубликованы, ряд работ по биолюминесцентции кишечнополостных, относящихся к разным классам, например i, i ii, ii и i . Шимомура предложил общее название для этих соединений цслентеразин и целентерамид для окисленной формы, в. V .