Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403

• Автор: Янышева, Наталья Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 203 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Синтез липолитических ферментов микроорганизмами

1.2. Характеристика свойств микробных липаз

1.2.1. Выделение и очистка препаратов липаз.

1.2.2. Физикохимические свойства и особенности строения нативных липаз

1.2.3. Специфичность действия микробных липаз.

1.3. Иммобилизация липолитических ферментов.

1.3.1. Физикохимические свойства иммобилизованных липаз.

1.4. Практическое использование липолнтитческих

ферментов
1.5. Заключение.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований.
2.2. Методы определения лнполитической активности
2.2.1. Определение активности титриметрическим методом
2.2.2. Определение активности липазы рНстатным методом.
2.3. Методы определения активности сопутствующих ферментов.
2.4. Метод количественного определения содержания белка.
2.5. Получение препаратов липазы различной чистоты
2.6. Электрофоретическое исследование препаратов липазы.
2.7. Определение молекулярной массы липаз
2.7.1. Метод гельфильтрации
2.7.2. Метод электрофореза в полиакриламидном геле
в присутствии БЭБ
2.8. Изоэлектрическое фокусирование липаз.
2.9. Определение аминокислотного состава липаз
2 Модификация липазы специфическими ингибиторами
2 Методы иммобилизации липазы.
2 Инфракрасная спектроскопия препаратов липазы
2 Определения содержания свободных жирных кислот в
маслах в процессе гидролиза.
2 Определение состава фракции свободных жирных кислот
в масле
2 Анализ продуктов гидролиза триглицеридов методами
тонкослойной и высокоразрешающей жидкостной хроматографии.
2 Методы исследования клейковины теста из пшеничной
муки, пшеничного крахмала.
2 Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЛИПАЗЫ
яниориз ОКУгЛЕ , ИЗУЧЕНИЕ их ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА И ФИЗИКОХИМИЧЕСКИХ свойств
3.1. Получение технических препаратов липазы
3.2. Получение высокоочищенных ферментных препаратов
3.3. Исследование некоторых физикохимических свойств изоферментов Липазы 1 и Липазы II
3.3.1. Исследование аминокислотного состава липаз.
3.3.2. Влияние и температуры на активность изоферментов
3.4. Заключение.
ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ
И КИНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЛИПАЗЫ I ЯНГЮРЕЗ ОЯ Г2АЕ
4.1. Исследование кинетических характеристик гидролиза трибутирина Липазой I
4.1.1 Влияние концентрации фермента на гидролиз
трибутирина.
4.1.2. Определение кинетических констант гидролиза трибутирина.
4.1.3. Исследование влияния температуры и на кинетические константы гидролиза трибутирина
4.1.4. Определение рК функциональных групп активного
центра Липазы I
4.2. Исследование функциональных групп активного центра Липазы I
4.2.1. Идентификация имидазольной группы Липазы I фотоокислением
4.2.2. Модификация Липазы I диэтилпирокарбонатом.
4.2.3. Модификация Липазы I нхломеркурибензоатом
4.2.4. Модификация Липазы I фенилметилсульфонилфторидом.
4.2.5. Механизм действия Липазы 1
4.3. Исследование специфичности действия липазы
Югорт огугае и определение кинетических характеристик ферментативного гидролиза триглицеридов
4.3.1. Субстратная специфичность препарата липазы ГХ
4.3.2. Кинетические параметры гидролиза триглицеридов Липазой 1.
4.3.3. Специфичность Липазы 1 к жирным кислотам.
4.3.4. Позиционная специфичность Липазы 1.
4.4. Заключение.
ГЛАВА 5. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЛИПАЗЫ ЯгОРЯ5 0К2ЛЕ
И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕЕ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
5.1. Адсорбция липазы на неионогенном носителе
5.1.1. Выбор оптимальных условий сорбции
5.1.2. Физикохимические свойства иммобилизованной липазы.
5.2. Иммобилизация липазы путем связывания с анионном АВ2П ПО
5.2.1. Метод иммобилизации липазы на анионите
5.2.2. Изучение физикохимических свойств липазы иммобилизованной на АВ2П.
5.2.3 Исследование характера взаимодействия липазы с
анионитом АВ2П методом ИКспектроскопии
5.2.4. Исследование кинетических характеристик гидролиза
трибутирина.
5.3. Непрерывный гидролиз растительного масла в реакторе с иммобилизованными липазами.
5.4. Заключение.
ГЛАВА 6. НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЛИПАЗЫ ЯНИОРШ 1У2АЕ В ХЛЕБОПЕЧЕНИИ
6.1. Динамика потребления глюкозы дрожжевыми клетками в присутствии масла и продуктов его гидролиза.
6.2. Влияние гндролизованного масла на свойства
клейковины пшеничного теста.
6.3. Изучение свойств пшеничного крахмала под действием
гидролизованного масла
6.3.1. Влияние масла на вязкость крахмальных растворов.
6.3.2. Исследование пластической прочности крахмального
6.4. Заключение.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


В настоящее время для разделения белков используются как уже ставшие традиционными гели сефадексы, ионообменные смолы , , гидрофобные i, , так и новые полимеры. Для каждого фермента разрабатывается уникальная схема очистки. На первых этапах получения высокоочищенных ферментных препаратов липаз обычно используют ультрафильтрацию иногда в два этапа, фракционирование сульфатом аммония, осаждение органическими растворителями. Липазы из iii i осаждали этанолом 2, из i ацетоном 5. Схемы очистки микробных липаз отличаются последовательностью стадий, способами элюции. При получении высокоочищенных препаратов липаз i, iii, i сначала использовали ионообменную хроматографию на 0М, 0М а затем гидрофобную на i 0М, 0М 7, 0. Липаза из i . Липазы из i v 2 и 4 очищены ионообменной хроматографией на первой ступени и фильтрацией через 0 и 4 па второй. Степень очистки составила 3 и раз соответственно. Для липаз из i 5 и ii 0 использовалась только фильтрация через различные носители. Очистка липазы i ii проводилась в 3 этапа. После гельфильтрации через x была достигнута очень высокая степень очистки раз, а дальнейшая фильтрация через и i 0 позволила получить фермент с очисткой в раз и выходом ,1 0. Коммерческий препарат липазы i ii был очищен до гомогенного сотояния с помощью i 6 Ivv и с кратностью и выходом 4. Различные изоформы липаз А и В вида i ii получены двумя различными способами. Форма А выделена сочетанием ионообменной хроматографии на элюцией в градиенте рИ 7,,5 аффинной хроматографией на и гидрофобной хроматографией на i5. Для выделения форм, В использовашл ионообменная и гидрофобная i хроматография и гельфильтрация через 4. Липазы i iiv фракционировали с помощью различных ионообменников. Разделения двух форм I и II удалось добиться хроматографией на СМ в 2 стадии элюцией различными концентрациями I 0, М и 0, М и далее в градиенте i I 6,,0 для липазы I и ,3 М I для липазы II. Форма I липазы была очищена в ,4 раза с выходом ,1 форма II ,9 и 3,1 соответственно 5. Некоторые трудности возникают при очистке липаз, имеющих гидрофобный характер молекулы. Например, при получении высокоочищенной липазы из iii i 7 с помощью 4 и Л в элюирующий раствор необходимо было добавить детергент. В результате получен гомогенный препарат со степенью очистки ,7 , с выходом 0,1 . В заключение можно отметить, что для каждого продуцента фермента необходимы исследования по выделению его в высокоочищенном или гомогенном состоянии с сохранением нативных свойств. Индивидуальные характеристики липаз во многом зависят от особенностей продуцента. Физикохимические свойства липаз могут значительно варьировать даже у микроорганизмов одного рода, что связано с видовыми, а иногда и штаммовыми различиями. Основные физикохимические показатели наиболее изученных микробных липаз проведены в табл. Большинство из них имеют рНоптимум в слабокислой, нейтральной или слабощелочной зонах температуру действия в пределах С. Некоторые обладают устойчивостью к щелочным значениям 9 4, 7 и стабильностью к высоким температурам 4, 2. Небольшая группа ферментов проявляет активность при низких температурах от 2 до С 4, 2, 9. Это явление необычное, но объяснимое, так как реакции могут протекать с большой скоростЕ. Молекулярная масса многих липаз микробного происхождения колеблется в интервале кДа, хотя встречаются и высокомолекулярные кДа, что является результатом ассоциации низкомолекуляриых форм белковых молекул 8, 0, 6, 4. Удельная активность липаз может составлять сотни и десятки тысяч см. Значения р1 свидетельствуют, что они могут быть как кислыми, так и нейтральными белками. Многие липазы активируются ионами Са2, 2 Ва2 и ингибируются ЭДТА, но общим правилом это не является. Соли желчных кислот могут также выступить как активаторами, так иингибиторами. В отличие от многих липаз ЯЫютисог ппеЬег активируется органическим растворителями, что необходимо в процессах синтеза. Таблица Т. Бактерии i ii 8,0 2,2,2 2, 2, 2. X ДХН 2. Трибы i i ВКЛЛ ВКЛБ 5. Соли 1 н 2х валентных металлов. Этанол. Дрожжи i ii 7. Лктнномнисты .