Разработка энантиоселективных биокатализаторов кинетического разделения рацемических спиртов, кислот и эфиров

• Автор: Хабибуллина, Ирина Ифировна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 138 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Введение. Ферменты и клетки биокатализаторы реакций

1.2 Липолитические ферменты

1.2.1 Биосинтез липаз

1.2.2 Скрининг микроорганизмовпродуцентов липаз

1.3 Структурно функциональные взаимодействия, возникающие при катализе липазами

1.4 Влияние органических растворителей на активность ферментов

1.4.1 Активность ферментов в присутствии органических растворителей

1.4.2 Суспензия биокатализаторов в неполярных и полярных органических растворителях

1.4.3 Модификация ферментов
1.4.3.1 Физическая модификация
1.4.3.2 Химическая модификация
1.4.3.3 Модификация с помощью методов генной инженерии
1.4.3.4 Специфические методы внешняя модификация
1.4.3.4.1 Твердые ферменты
1.4.3.4.2 Методы увеличения энантиоселективности липаз
1.5 Ферментативные реакции в органических растворителях
1.6 Методы получения оптически активных веществ
1.6.1 Стереоселективный синтез на основе прохиральных предшественников и мезосоединений
1.6.2 Дерацемизация рацемических смесей с помощью ферментов
1.6.3 Физикохимические методы разделения
1.7 Практическое применение липаз в разделении рацемических смесей
1.7.1 Кинетическое разделение рацемических спиртов с помощью липаз
1.7.2 Кинетическое разделение рацемических спиртов с помощью цельноклеточных биокатализаторов
1.8 Получение оптически активных хроманов
1.9 Получение оптически активного 8кетопрофена
1. Заключение
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объекты исследований
2.2 Материалы и реагенты
2.3 Методы исследования
2.3.1 Культивирование микроорганизмов
2.3.2 Получение накопительных культур
2.3.3 Выделение чистых культур микроорганизмов
2.3.4 Хранение микроорганизмов
2.3.5 Идентификация микроорганизмов
2.3.6 Обработка биомассы ацетоном и другими органическими растворителями
2.3.7 Синтез оптически активных соединений
2.3.7.1 Гидролиз хроманилэтилацетата и бутилового эфира кетопро
. Ацилирование хроманилэтанола и переэтерификация кетопрофена в органических растворителях
2.3.7.3 Ацилирование вторичного спирта в органическом растворителе
2.3.7.4 Гидролиз ацетатов вторичных спиртов в водном растворе
2.3.8 Определение концентрации белка и биомассы
2.3.9 Определение эстеразной и липолитической активности
2.3. Определение концентрации субстратов и продуктов трансформации
2.3. Идентификация продуктов трансформации
2.3. Определение оптической чистоты продуктов
биотрансформации 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Разработка энантиоселективных биокатализаторов для кинетического разделения 6бензилоксигидроксиэтил2,5,7,8тетраметилхромана и 6бензилоксиацетоксиэтил2,5,7,8 тстраметилхромана
3.1.1 Скрининг микроорганизмов, обладающих гидролазной активностью
3.1.2 Поиск энантиоселективных биокатализаторов для получения оптически активных хроманолов
3.1.2.1 Исследование ацилирования хроманилэтанола в органических растворителях
3.1.2.2 Исследование условий ацилирования хроманилэтанола винилацетатом в присутствии клеточных катализаторов на основе культур микроорганизмов и 9 в системах ацетонизооктан
3.1.2.3 Исследование биокатализируемого процесса гидролиза хроманилэтилацетата
3.2 Разработка энантиоселективных биокатализаторов для кинетического разделения кетопрофена
3.2.1 Поиск потенциальных биокатализаторов для кинетического разделения рацемической бензоилфенилпропионовой кислоты кетопрофена
3.2.2 Исследование иереэтерификации кетопрофена
3.3 Идентификация перспективных биокатализаторов
3.4 Поиск методов увеличения активности, найденных биокатализаторов кинетического разделения рацемических хроманов и кетопрофена
3.4.1 Исследование линолитической и эстеразной активности клеток
3.4.2 Исследование влияния способа обработки биомассы на гидролазную активность клеточных катализаторов
3.5 Разработка методов получения 8хроманилэтанола и 8кетопрофена
3.5.1 Энантиоселективный гидролиз рацемического хроманилэтилацетата с помощью биокатализатора на основе микроорганизма рода
3.5.2 Двухступенчатая переэтерификация кетоирофена в присутствии биокатализатора на основе микроорганизма рода i КЗ2
3.6 Увеличение активности биокатализаторов, используемых в процессах кинетического разделения вторичных спиртов и их эфиров
3.6.1 Разработка однореакторного хемобиокаталитического синтеза оптически активных вторичных спиртов с помощью клеточных биокатализаторов
ВЫВОДЫ
Список использованных источников


Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности Биотехнология. Апробация работы. Успехи интеграции академической и вузовской науки по химическим специальностям Уфа,
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 статьи. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы глава 1, описания объектов, материалов и методов исследования глава 2, обсуждения результатов глава 3, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 2 страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц. Введение. В последние два десятилетия область биокатализа, включающего использование ферментов и клеток микроорганизмов в органическом синтезе, очень быстро развивается 1. Использование методов биотрансформации является весьма перспективным подходом в синтезе природных соединений, обладающих сложной структурой и содержащих хиральные центры. Синтез лекарственных средств, получение экологически чистых пестицидов нового поколения регуляторов поведения насекомых феромонов и других видоспецифичных аттрактантов и репеллентов, пищевых и ароматических добавок является важной задачей. Использование энантиоселективных ферментов и клеток микроорганизмов является перспективным подходом получения оптически активных синтонов, основным преимуществом которых является малая энергоемкость, вследствие мягких условий протекания реакций, высокая селективность, близкая к 0, не зависящая от степени превращения исходного субстрата, а также стереоспецифичность, заключающаяся в образовании хиральных соединений. Методы биотрансформации используются не только для разделения рацематов биологически активных веществ, но и для их синтеза, и могут конкурировать с химическими методами и существенно расширяют возможности органического синтеза 2. Таким образом, возросшее понимание возможностей использования биокатализаторов для проведения стерео, регио и хемоселективных реакций, ведт к осознанию новых широких возможностей, открываемых интеграцией химических и биотехнологических методов получения органических веществ и материалов. Все возрастающий интерес к природным биокатализаторам является одним из важнейших элементов научнотехнической стратегии, базирующейся на использовании легко возобновляемых ресурсов живой природы 3. Технологически привлекательными и широко используемыми в последние лет в лабораторном и промышленном синтезе инструментами являются липолитические ферменты, в первую очередь протеазы и эстеразы и, в особенности, специфическая разновидность последних, липазы КФ 3. Ценнейшим свойством липаз, занимающих особое место среди гидролитических ферментов, является способность катализировать как реакции гидролиза липидов и сложных эфиров в гетерофазных средах типа водамасло, так и обратные реакции ацилирования спиртов, трансэтерификации в органических растворителях или в водноорганических системах. Липиды, природные субстраты липаз сильно ассоциированы в водной среде, поэтому поверхностная активация фермента происходит именно в контакте с границей раздела фаз 4. Это явление может быть отнесено к уникальным структурным характеристикам этого класса ферментов 5. В отличие от большинства металлоферментов оксидоредуктаз, киназ и др. Кроме своих естественных субстратов триглицеридов, липазы проявляют достаточную широкую субстратную специфичность и способны гидролизовать многие другие сложные эфиры, содержащие, как правило, остатки липофильных спиртов и низших СгСб жирных кислот. Сочетание широкой субстратной специфичности с выраженной хемо, регио и энантиоселективностью делает липазы ценным инструментом органического синтеза. Обычно их используют на ключевых стадиях направленного синтеза для получения нужного энантиомера из рацемата. Между тем, есть область целевого синтеза, где применение липаз имело бы стратегическое значение это идентификация носителя активности в биологически активном рацемате и аналогичные ей задачи 3.