Роль горизонтального переноса плазмид биодеградации в микробной деструкции полициклических ароматических углеводородов

• Автор: Ахметов, Ленар Имаметдинович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 163 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИЕ АРОМАТИЧЕСКИЕ УГЛЕВОДОРОДЫ КАК ЗАГРЯЗНИТЕЛИ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

1.2. ДЕГРАДАЦИЯ ПАУ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ

1.2.1. Биохимические пути деградации нафталина микроорганизмами

1.2.2. Биохимические пути деградации фенантрена микроорганизмами

1.3. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ БИОДЕГРАДАЦИИ ПАУ

1.3.1. Гены катаболизма ПАУ грамотрицательных бактерий

1.3.2. Гены катаболизма ПАУ грамположительных бактерий

1.4. ПЛАЗМИДЫ БИОДЕГРАДАЦИИ. ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМ РЕПЛИКАЦИИ, НАСЛЕДОВАНИЯ И ПЕРЕНОСА ИЗВЕСТНЫХ ПЛАЗМИД I9 ГРУППЫ

1.5. КОНЪЮГАЦИОННЫЙ ПЕРЕНОС КАТАБОЛИЧЕСКИХ ПЛАЗМИД В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

1.5.1. Системы для изучения переноса катаболических плазмид и генов

1.5.1.1. Исследование горизонтального переноса катаболических плазмид в почве
1.5.1.2. Перенос катаболических плазмид в жидких и полужидких средах
1.5.1.3. Исследование горизонтального переноса катаболических плазмид в присутствии растений
1.5.2. Подходы к мониторингу бактериальных штаммов доноров, реципиентов и траисконъюгантов и переноса катаболических плазмид
1.5.2.1. Морфология колоний бактерий, ауксотрофность, репортерные гены флюоресценции и люминесценции
1.5.2.2. Использование индикаторных агаризованных сред
1.5.2.3. Антибиотикорезистентность
1.5.2.4. Визуализация плазмид, ПЦР и гибридизация
1.5.2.5. Мониторинг переноса плазмид с использованием селективных
катаболических признаков
1.5.2.6. Косвенный мониторинг переноса катаболических плазмид
1.5.3. Влияние различных факторов на перенос катаболических плазмид и деградацию поллютантов
1.5.3.1. Наличие селективного давления
1.5.3.2. Влияние типа почвы на перенос плазмид
1.5.3.3. Наличие питательных веществ
1.5.3.4. Горячие пятна переноса плазмид участки с благоприятствующими плазмидному переносу условиями
1.5.3.5. Эффект влажности при горизонтальном переносе катаболических плазмид
1.5.3.6. Температура как один из факторов, влияющих на плазмидный перенос
1.5.3.7. Выбор донорного штамма
1.5.3.8. Наличие филлосферы и ризосферы листвы и корневой системы растений
1.5.3.9. Присутствие почвенной биоты и перенос плазмид
1.6. КАТАБОЛИЧЕСКИЕ НЕПЛАЗМИДНЫЕ МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ
1.6.1. Транспозоны
1.6.2. Геномные острова
1.6.3. Горизонтальный перенос катаболических нсплазмидных МГЭ
1.7. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ ПАУ
1.7.1. Биодеградация ПАУ в лабораторных условиях
1.7.2. Полевые и пилотные исследования биодеградации ПАУ
1.7.3. Увеличение скорости и степени деградации ПАУ
1.7.3.1. Способы повышения биодоступности ПАУ
1.7.3.2. Стимуляция метаболической акгивности микроорганизмовдеструкторов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Среды, источники углерода и антибиотики
2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов
2.4. Трансформация клеток . i плазмидной ДНК
2.5. Коньюгационный перенос бактериальных плазмид
2.6. Выделение плазмидной ДНК
2.7. Визуализация плазмидной ДНК
2.8. Определение влагоемкости почвы
2.9. Приготовление модельных почвенных систем
2 Внесение инокулята в почву
2 Отбор проб
2 Экстракция нафталина из почвенных образцов
2 Определение концентрации нафталина в почвенных экстрактах
2 Определение содержания салицилата в культуральной жидкости
2 Мониторинг маркированных плазмидосодержащих штаммовдеструкторов в процессе деградации нафталина в почве
2 Определение активностей ключевых ферментов биодеградации нафталина
2 Определение концентрации белка
2 Определение стабильности признаков утилизации нафталина и салицилата
2 Выделение тотальной ДНК бактериальных штаммов
2 Полимеразная цепная реакция
2 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2 Рестрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК
2 Устройство экспериментального открытого биореактора
2 Подготовка инокулята для биореактора
2 Мониторинг штаммовдеструкторов в культуральной среде
2 Определение остаточного содержания нефти и нефтепродуктов в культуральной среде
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Конструирование маркированных штаммовдеструкторов Р. i 2 Тс и Р. i
3.2. Определение удельной скорости роста штаммовдеструкторов на нафталине
3.3. Стабильность признаков биодеградации и резистентности,
контролируемых плазмидой р 2ТпАоОТс
3.4. Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в лабораторных условиях
3.4.1. Характеристика аборигенных деструкторов нафталина
3.4.2. Динамика общей численности микроорганизмов и бактерийдеструкторов нафталина в модельной почве
3.4.3. Динамика убыли нафталина в почве и горизонтальный перенос плазмид биодеградации в бактериальных популяциях
3.4.4. Оценка активности ключевых ферментов катаболизма нафталина бактерийдеструкторов
3.5. Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в почве в открытой окружающей среде
3.5.1. Мониторинг и продуцированных маркированных бесплазмидных и плазмидосодержащих штаммов, их выживаемости и конкурентоспособности
в открытой окружающей среде
3.5.2. Горизонтальный перенос плазмид биодеградации в почвенных микробных популяциях
3.6. Горизонтальный перенос плазмиды биодеградации нафталина в
открытом биореакгоре с протоком нефти и дизельного топлива
3.6.1 Характеристика аборигенных деструкторов нафталина
3.6.2. Динамика общей численности микроорганизмов и бактерийдеструкторов в биореакгоре
3.6.3. Деструкция дизельного топлива и нефти в биореакгоре
3.6.4. Горизонтальный перенос катаболической плазмиды в проточном 9 биореакгоре
3.7. Разработка метода для оценки эффективности биодеградации нафталина 1 штаммамидеструкгорами в модельных почвенных системах
4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Предложен новый метод, позволяющий сравнить и выбрать наиболее активные штаммыдеструкторы, перспективные для биоремедиации загрязненных ПАУ территорий, который основан на определении значений основных кинетических параметров микробного роста и утилизации ПАУ. Разработана математическая модель, описывающая рост бактерий и потребление ими субстратов нафталин, его производные и органические вещества почвы в модельных почвенных системах. С помощью предложенного метода проведено сравнение эффективности процесса биодеградации нафталина различными штаммами родов и i и выявлен наиболее эффективный штаммдеструктор . ВКМ ВД. Полученные в работе результаты по изучению горизонтального переноса плазмид деградации нафталина в модельных почвенных системах и открытой окружающей среде создают предпосылки для дальнейших более детальных исследований горизонтального переноса катаболических генов и плазмид и роли переноса генов в микробной деструкции ПАУ с более высоким молекулярным весом. Выдвинуто предположение, что плазмидный перенос в обратном направлении, из интродуцированного штаммадонора в аборигенный бактериальный реципиент, также может быть эффективным при осуществлении биоремедиации участков, загрязненных ПАУ. Предложенный метод для оценки эффективности процесса биодеградации ПАУ с использованием разработанной математической модели может быть применен для выбора наиболее активных штаммовдеструкторов, перспективных для использования в биотехнологии защиты окружающей среды. Обнаружение природных плазмид биодеградации в исследуемых штаммахдеструкторах нафталина предполагает их дальнейшее исследование, направленное на выяснение закономерностей струкгурнофункциональной организации генетических систем биодеградации ПАУ. Материалы диссертации были представлены на й школахконференциях молодых ученых Биология наука го века Пущино, , между народных съездах и конференциях i iii , , i i Ii i i i i i i i, , i, , Ii iii ii i i, . По материалам диссертации опубликовано работ, в том числе 2 статьи, заявка на получение патента РФ на изобретение и 9 тезисов. Диссертация состоит из разделов Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и Список литературы. Работа изложена на 3 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц и рисунков. Библиография насчитывает 1 наименование, из них отечественная и 0 зарубежных работ. Полициклические ароматические углеводороды ПАУ являются группой широко распространенных гидрофобных соединений Рис. Клар, Ровинский и др. Рис. Полициклические ароматические углеводороды. Механизм образования ПАУ в процессе сгорания комплексный процесс, происходящий в результате деполимеризации углеводородных фрагментов, которые формируются в результате крекинга больших молекул. Такой процесс реполимеризации обычно происходит в условиях неполного сгорания топлива, когда с уменьшением концентрации кислорода увеличивается содержание ПЛУ . Несмотря на то, что концентрация ПАУ в воздухе составляет 0,1 от содержащихся в воздухе загрязнителей, этой проблеме уделяется особое влияние, так как многие из них относятся к классу канцерогенов и мутагенов, что было подтверждено в опытах на животных I, . В воздухе часть ПАУ подвергается абиотической деградации вследствие взаимодействия со свободными радикалами, другая часть адсорбируется на пылевых частицах и осаждается на поверхности почвы. Адсорбированные на частичках пыли ПАУ образуют аэрозоли, которые при вдыхании оказывают негативное влияние на здоровье человека. Проблема загрязнения воздуха такими соединениями стоит остро для многих крупных городов и промышленных центров . В последнее время очень серьезную проблему представляет загрязнение ПАУ водных систем. Использование креозота основными компонентами которого являются нафталин, фенантреи, антрацен, хризен в судоремонтных работах приводит к накоплению его компонентов в организме морских моллюсков и ракообразных. Отлов ракообразных в некоторых районах Атлантического побережья Канады был прекращен изза накопления высоких концентраций ПАУ в их организме . Накопление ПАУ в морских акваториях вызывает образование опухолей у рыб и неблагоприятно сказывается на популяциях их многих ценных видов .