Определение видовой принадлежности клеточных культур методами молекулярно-генетического анализа

• Автор: Кулешов, Константин Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Щёлково
• Количество страниц: 150 с. : ил.

Содержание

Список условных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Проблема межвидовой контаминации клеточных культур.

1.2. Традиционные методы определения видовой принадлежности клеток в культуре

1.2.1. Изоферментный анализ клеточных культур.

1.2.2. Кариологический анализ.

1.2.2.1. Закономерности изменения кариотипа клеток длительнокультивируемых i vi

1.3. Молекулярногенетические методы видовой идентификации

1.3.1. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК Г1ДРФ .

1.3.2. ПЦР с использованием произвольных праймеров
1.3.3. Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов
1.3.4. ПЦРПДРФ анализ
1.3.5. Видоспецифичная ПЦР
1.3.6. Секвенирование маркерных последовательностей.
Глава 2. Собственные исследования.
2.1. Материалы и методы исследования
2.1.1 Материалы.
2.1.1.1. Реактивы, препараты и оборудование.
2.1.1.2. Клеточные культуры.
2.1.1.3. Образцы тканей.
2.2.1. Методы.
2.2.1.1. Культивирование и криоконсервация клеточных культур
2.2.1.2. Кариологический анализ клеточных культур.
2.2.1.2.1. Приготовление кариологических препаратов.
2.2.1.2.2. Рутинная окраска препаратов
2.2.1.2.3. Окраска на Ополосы
2.2.1.2.4. Анализ хромосомных препаратов
2.2.1.3. Молекулярногенетический анализ видовой принадлежности клеточных культур.
2.2.1.3.1. Выделение ДНК
2.2.1.3.2. Определение нуклеотидной последовательности участков мтДНК.
2.2.1.3.3. Видоспецифичная ПЦР
2.2.1.3.4. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Кариологический анализ клеточных культур.
3.1.1. Клетки линии К2 промиелоцентарного лейкоза человека
3.1.2. Клетки почки кролика, линия ЯК
3.1.3. Соматический гибрид свиных клеток, линия А4ХС2.
3.1.4. Соматический гибрид клеток свиньи и лошади, линия А4хЬ
3.1.5. Клетки кожи лошади, линия ЭКЛ
3.1.6. Клетки почки коровы, линия МЕВК.
3.1.7. Клетки легкого коровы, линия ЛЭК.
3.1.8. Клетки почки собаки, линия МВСК
3.2. Оценка изменчивости и информативности участков генов суЛ и СОГ в
клеточных культурах.
3.3. Разработка методики определения видовой принадлежности культур клеток на основе вГТЦРРВ.
3.3.1. Выбор диагностической мишени, конструирование видоспецифичных праймеров и зондов
3.3.2. Первичная оценка сконструированных олигонуклеотидов и оптимизация условий проведения вПЦРРВ
3.3.3. Разработка и оптимизация мультиплексной вПЦРРВ
3.3.3. Изучение чувствительности разработанной вПЦРРВ.
3.3.4. Изучение специфичности разработанной вПЦРРВ.
3.4. Видовая идентификация культур клеток с использованием вПЦРРВ и анализа нуклеотидных последовательностей участков генов су6 и С.
Обсуждение результатов исследований.
Практические предложения
Список литературы


Высокая аналитическая чувствительность, специфичность и универсальность по отношению к анализируемому материалу позволяет расширить область применения и использовать данную методику для видовой идентификации широкого спектра биологических объектов. Дополнительное использование подхода на основе секвенирования участков мтДНК при помощи универсальных праймеров, позволяет значительно расширить спектр идентифицируемых видов животных. Стабильность и сохранение информативности участков генов и I мтДНК в условиях длительного культивирования i vi и использования их в целях видовой идентификации клеточных культур. Разработка методики видовой идентификации клеточных культур с использованием ПЦР с детекцией продукта амплификации в режиме реального времени. Сравнительная оценка результатов кариологического анализа и вПЦРРВ. Использование вПЦРРВ и секвенирования участков мтДНК для мониторинга и скрининга на видовую принадлежность клеточных культур, полученных от разных видов животных. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии Дубровицы, г. Школеконференции молодых ученых Методы культивирования клеток СанктПетербург, октябрь г. Пущино, г. ВИЭВ г. По теме диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Диссертационная работа изложена на 0 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы таблицами, рисунками. Список литературы включает 0 публикаций, в том числе 2 иностранных. Представленная диссертационная работа является результатом собственных научных исследований автора. Культивирование клеточных культур и их цитогенетический анализ выполнялись на базе Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН, отдел клеточной биотехнологии, зав. Л.П. Дьяконов. ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, зав. .. Штиль. Автор выражает благодарность за участие в выполнении отдельных фрагментов диссертации сотрудникам ВИЭВ РАСХН к. Т.В. Гальнбек, к. Е.А. Завьяловой, к. Н.Ф. П.М. Кленовицкому к. Гладырь Е. А. сотрудникам НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН д. .. Штилю, д. Г.М. Волгаревой, к. О.Ю. Сусовой сотрудникам НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН д. Подчерняевой Р. Я., Гринкевич О. Глава I. В конце х годов в литературе появилось множество сообщений о новых штаммах клеток, полученных из органов и тканей лабораторных грызунов, КРС, свиньи, приматов. Были получены и линии клеток человека, в том числе и существующие поныне КВ , , iv , . 2 i , . Получение некоторых постоянных клеточных линий, описываемых в е годы, связано со своеобразными превращениями, суть которых заключается во внезапном появлении в культивируемой популяции фокусов клеток, резко отличающихся от исходных по морфологии и характеру роста. Эти клетки в силу большей жизнеспособности и высокой скорости роста быстро размножались, через несколько пассажей полностью замещали родительскую популяцию и давали начало так называемой бессмертной постоянной линии. В х годах этот процесс рассматривали как трансформацию клеток i vi и считали необходимым условием стабилизации клеточной культуры i , . Привлекал, однако, внимание однотипный характер превращений во всех случаях независимо от видового происхождения клеточной культуры внезапно появляющиеся в ней клетки по морфологии, характеру и скорости роста были неотличимы от клеток и . Сходство проявлялось также в биохимических свойствах i и др. , , в характере роста в губке i . Такие изменения наблюдали , и и др. и др. и i в клеточных культурах кролика и обезьяны в клетках кролика.