Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином

• Автор: Грачева, Мария Андреевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы .

1.1. Характеристика рицина.1Ь

1.1.1. Рибосоминактивирующие лектины.

1.1.2. Строение рицина и его действие на эукариотические клетки

1.1.3. Биосинтез рицина

1.1.4. Транспорт рицина в клетках млекопитающих

1.1.5. Действие Асубъединицы рицина на рибосомы.

1.1.6. Иммунологические свойства рицина

1.2. Профилактика и лечение отравлений рицином.

1.2.1. Воздействие рицина на организм животных.

1.2.2. Разработка антидотов против рицина
1.2.3. Разработка вакцин против отравлений рицином.
1.2.4. Разработка тестсистем для обнаружения рицина.
1.3. Применение субъединиц рицина в медицине.
1.3.1. Иммунотоксины.
1.3.2. Адъюванты для создания вакцин.
1.4. Использование технологии создания химерных белков дя получения рекомбинантных антигенов.
1.4.1. Аффинные домены и белкиносители
1 Л.2. Применение целлюлозы, как иммуносорбента
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть а
2.1. Материалы и реактивы
2.1.1. Плазмидные векторы и олигонуклеотиды
2.1.2. Бактериальные штаммы и среды
2.1.3. Ферменты
2.1.4. Сорбенты
2.1.5. Другие реактивы.
2.1.6. Буферные растворы
2.1.7. Лабораторные животные.
2.1.8. Оборудование л
2.2. Основные методики.
2.2.1. Выделение ДК клещевины.7 Г
2.2.2. Полимеразная цепная реакция.
2.2.3. Химикоферментативный синтез
2.2.4. Сайтспсцифичсский мутагенез
2.2.5. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами
2.2.6. Фракционирование.фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.
2.2.7. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля.
2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК
2.2.9. Выделение и очистка аналитического количества плазмидной ДНК
2.2 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.
2.2 Определение нуклеотидных последовательностей плазмидных ДИК . 2.2 Подготовка компетентных клеток . i для трансформации плазмидной
ДНК электропорацией
2.2 Трансформация клеток . i.
2.2 Электрофорез белков в ПААГДСН.
2.2 Выращивание штаммапродуцента и индукция синтеза рекомбинантных белков.
2.2 Определение растворимости белков.
2.2 Определение нериплазматической локализации белков
2.2 Выделение и очистка белков, содержащих Ейаффинную метку
2.2 Выделение и очистка белков, содержащих .
2.2 Иммунизация кроликов.
2.2 Непрямой ИФА.
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Получение рекомбинантных аутентичных и
3.1.1. Клонирование нуклеотидной последовательности аутентичной
3.1.2. Клонирование нуклеотидной последовательности аутентичной
3.1.3. Экспрессия рекомбинантных генов аутентичных и в клетках . i 5.
3.2. Получение рекомбинантной мутантной
3.2.1. Клонирование нуклеотиднойпоследовательности мутантной
3.2.2. Экспрессия рекомбинантного гена мутантной в клетках . i М
3.3. Получение химерных белков и в цитоплазме . i
3.3.1. Клонирование гибридных генов химерных белков и .
3.3.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков и в клетках . i 5.
3.4. Получение химерных белков и и исследование их иммуногенных и антигенных свойств.
3.4.1. Клонирование гибридных генов химерных белков и .
3.4.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков и в клетках . i М
3.4.3. Выделение и очистка химерных белков и
3.4.4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков и
3.5. Получение химерных белков и в периплазме . i и исследование их иммуногенных и антигенных свойств.
3.5.1. Клонирование гибридных генов химерных белков i и i
3.5.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков i и i в . i 5.
3.5.3. Выделение и очистка химерных белков и
3.5.4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков и
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
Список сокращений
АГ аппарат Гольджи
а.о. аминокислотный остаток
БСА бычий сывороточный альбумин
ВОЗ Всемирная организация здравоохранения
ДСП додецилсульфат натрия
ИПТГ изопропил 1тиорПгалактопиранозид
ИТ иммунотоксин
ИФА иммуноферментный анализ
кДа килодальтон
п.н. пара нуклеотидов
ВД летальная доза
ОП оптическое поглощение
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
РИБ рибосоминактивирующие белки
ТГС трансГольджи сеть
ЭДТАэтилендиаминтетрауксусная кислота
ЭР эндоплазматический ретикулум
целлюлозосвязывающий домен
ди гидрофолат редуктаза
факгор элонгации
ЭРассоциированная деградация белков
глутатион8трансфераза
МВР мальтозосвязывающий белок
нитрилотриуксусная кислота
Асубъединица рицина
Всубъединица рицина
ТАР транспортеры, ассоциированные с процессингом антигенов Для обозначения аминокислотных остатков, нуклеотидов, олиго и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии I и Международного союза биохимиков I.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В это же время Пауль Эрлих, иммунизируя животных рицином и абрином, открыл специфичность иммунитета. Он обнаружил появление в сыворотке крови специфических белков, прецшштирующих токсин, что легло в основу iморальной теории иммунитета. Интенсивные исследования структуры и механизма действия токсинов начались с х годов, когда было показано, что абрин и рицин более токсичны для клеток асцита Эрлиха, чем для нормальных клеток и, следовательно, могут найти применение в терапии опухолей. К настоящему времени охарактеризовано обширное семейство белков, обладающих способностью ферментативно инакгивировать рибосомы. Способность гидролитически вьнцеплять инвариантный аденин из высококонсервативной области рРНК гликозидазная активность является характерным признаком белков этого семейства, называемых рибосоминактивирующими белками РИБ. Семейство РИБ разделяют на два типа РИБ типа 1 далее РИБ1 и РИБ типа П далее РИБП. РИБ1 мономерные белки, состоящие только из одной активной субъединицы цепи, отвечающей как раз за ферментативные свойства белка. РИБ широко распространены у растений, а также среди грибов и водорослей. К настоящему времени известно более белков этого типа. РИБП состоят из двух субъединиц, приблизительно по кДа каждая, соединенных дисульфидной связью, одна из которых гомологична РИБ Асубъединица, или Ацепь, а другая обладает лектиновыми свойствами Всубъсдиница, или Вцепь. Вцепь обеспечивает связывание РИБ с клеткамимишенями и их внутримолекулярный транспорт. Поэтому РИБГ также называют рибосоминактивирующими лектинами. В группу РИБ входят такие мощные растительные токсины, как рицин, абрин и модецин, а также относительно нетоксичные нигрин и эбулин бузины ii. К РИБИ относятся также бактериальные токсины шига токсин, продуцируемый i i и шигапод обные токсины, продуцируемые энтсрогсморрагическими штаммами ii i. Структура шига и шигаподобных токсинов несколько отличается от структуры типичных РИБП. Эти токешгы состоят из Асубъсдиницы, гомологичной РИБ1, нековалентно связашой с пентамером из пяти одинаковых Всубъединиц молекулярная масса 7,7 кДа, которые специфически связывают галабиозные остатки гликолипидов клеточных мембран, в основном глоботриаозилцерамида 3. Аналогичную структуру, состоящую из двух субъединиц, А и В, имеют и такие токсины как дифтерийный токсин, токсин сибирской язвы и ботулизма. Основная субъедшшчная структура РИБП АВструктура у некоторых РИБ может димеризоваться ковалентно или нековалентно. Гак, например, агглютинин клещевины образует тетрамеры типа В, в которых Асубъсдиницы димера АВ связаны дисульфидной связью. Токсический лектин омелы I образует нековалентно ассоциированные димеры типа АВ2 , ,. В настоящее время известно уже более двух десятков РИБ. Характерно, что, как правило, из одного вида растений выделяют несколько вариантов РИБ, кодируемых разными генами, по имеющих сходную первичную структуру. Так, семена клещевины содержат рицин и агглютинин клещевины, идентичные на , листья омелы Vi вискумин и МЫ, II и III i i, идентичные на . РИБ в отличие от РИБИ не обладают токсичностью для эукариотических клеток, гак как в них отсутствует Вцепь, которая необходима для связывания белка с клеткамимишенями и его направления во внутриклеточное пространство, где далее белок может проявить свою ферментативную активность, связанную с депуринизацией рРНК. Рицин наиболее хорошо изученный РИБ, кристаллическая структура которого определена и детально описана , . Он представляет собой гликопротеин с глобулярной структурой рис. Рис. Трехмерная структура молекулы рицина, смоделированная на основе данных рентгеноструктурного анализа . Значком отмечены молекулы лактозы. Молекулярная масса рицина составляет приблизительно кДа . Белковая часть молекулы рис. Асубъединицы iv и лектиновой Всубъединицы ii, соединенных одной дисульфидной связью . В результате взаимодействия концевых аминокислотных остатков а. Сконцевым участком формируется удлиненная структура, которая содержит экспонированную на поверхность молекулы дисульфидную связь рис.