Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов

• Автор: Бондарь, Владимир Станиславович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 259 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Способы получения исходных белковых препаратов

1.2. Методы разделения белков с помощью осаждения, общие представления

1.3. Фракционирование белков посредством их распределения между жидкими фазами, общие принципы метода

1.4. Разделение биомолекул с помощью ультрафильтрации, общий принцип метода.

1.5. Методы разделения белков посредством адсорбции, общие положения и типы хроматографий.

1.5.1. Адсорбенты, применяемые в хроматографии белков

1.5.2. Методы элюции белков, адсорбированных на носителе, общие принципы.

1.6. Аффинная хроматография, общие принципы метода.

1.7. Гельфильтрационная хроматография белков, общие принципы метода.
1.8. Электрофоретическое разделение белков, общие положения и основные методы
1.9. Лигандообменная хроматография, общие принципы метода
1.9.1. Применение лигандообменной хроматографии для разделения
белковых молекул.
1 О возможности применения наноалмазов детонационного синтеза как новых сорбентов в технологиях выделения и очистки белков.
1 Резюме обзора литературы.
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА ЛОРБ, ПРОВЕРКА ЕГО ПРИМЕНИМОСТИ В МОДЕЛЬНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ.
3.1 Предпосылки создания метода ЛОРБ обнаружение феномена преципитации белков под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов
3.2 Сравнительный анализ действия ионов кальция и кадмия на белки в экстрактах из бактериальных клеток . i
3.3 Рассмотрение феномена преципитации белков в растворе под действием ионов двухвалентных металлов с позиций координационной и белковой химии
3.4 Обоснование и основные положения метода ЛОРБ.
3.5 Проверка метода ЛОРБ в модельных экспериментах по разделению смеси маркерных белков
ГЛАВА 4. МЕТОД ЛОРБ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ СВЕТОИЗЛУЧАЮЩИХ БЕЛКОВ
4.1. Метод ЛОРБ при выделении рекомбинантного апообелина
4.2. Выделение апоакворина и мутантов апофотопротеинов
4.3. Применение технологии ЛОРБ для очистки рекомбинантной бактериальной люциферазы.
4.4. Обобщающая технологическая схема выделения белков,
основанная на применении метода ЛОРБ.
ГЛАВА 5. ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЧАСТИЦ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ.
5.1. Физикохимические свойства наноалмазов детонационного синтеза как базовая основа возможности использования данного материала для сепарации белковых молекул.
5.2. Модельные исследования с маркерными белками проверка адсорбциидесорбции белковых молекул на поверхности наноалмазов,
определение сорбционной емкости наночастиц к белку
ГЛАВА 6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЖОВ.
6.1. Выделение рекомбинантного апообелина с помощью наноалмазов.
6.2. Применение детонационных наноалмазов для выделения рекомбинантной люциферазы.
6.3. Выделение глутатионредуктазы с использованием наноалмазов.
6.4. Применение наноалмазов для выделения лизоцима.
6.5. Механизмы взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц наноалмаза.
6.6. Детонационные наноалмазы новый сорбент для колоночной хроматографии.
ГЛАВА 7. БИОТЕХНОЛОГИИ, ОСНОВАННЫЕ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИИ БЕЖОВЫХ МОЛЕКУЛ С ЧАСТИЦАМИ НАНОАЛМАЗОВ.
7.1 Получение композиционных материалов из наночастиц разной физической природы с применением белков как сшивающих агентов.
7.2. Создание систем индикации биочипов на основе комплекса наноалмазмаркерный белок.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Г.Дегерменджи за возможность исследований, направленных на разработку и создание новых нанобиотехнологий с использованием частиц наноалмазов, и поддержку данного направления в ИБФ СО РАН. Я благодарен моим коллегам А. П.Пузырю и К. В.Пуртову, которые являются моими основными сподвижниками и соавторами, принимавшими самое непосредственное участие в создании новых технологий выделения и очистки белков. ИБФ СО РАН генным инженерам Б. А.Илларионову и В. А.Илларионовой за создание штаммов продуцентов рекомбинантного апоакворина, апообелина, а также мутантов апообелина с заменами консервативного цистеина 8, которые были использованы в работе для выделения этих белков Е. С.Высоцкому и С. В.Марковой за предоставленную возможность работы с штаммамипродуцентами мутантных форм апофотопротеинов с делециями концевых участков молекул И. В.В. Вилфреду Р. Хагену и доктору Жаку Вервурту . Рою Квинлану i из Университета города Дарема Великобритания ii ii i, ivi , за проведение независимой экспертной оценки технологии выделения апообелина с помощью частиц наноалмазов и создания прототипа биолюминесцентного биочипа с помощью наноалмазов и обелина. ГЛАВА 1. Написание этого раздела работы вызывало определенные затруднения. Это связано с колоссальным объемом информации, которая накоплена в области разделения и очистки веществ. При таком обилии материала наиболее разумным выходом представлялось рассмотреть только те аспекты, которые позволили бы составить общее представление о направленности исследований представленной работы. Автор старался придать описанию материала практический оттенок, исходя из биотехнологического характера самой работы и опираясь на собственный многолетний опыт выделения и очистки белков. Проблемы выделения и очистки биополимеров занимают одно из центральных мест в современной биохимии. В начальный период развития биологической химии работы по изучению свойств и механизмов действия биологических макромолекул, например, биокатализа проводились на грубых белковых препаратах гомогенаты и экстракты тканей. Конечно, применение реагентов например, ингибиторов, модификаторов, вычленяющих одну или несколько биохимических реакций, и использование методов определения специфической активности фермента позволяет проводить оценку той или иной реакции достаточно локально. Однако наличие в исходных тканевых препаратах значительного количества различных компонентов, прежде всего, многих ферментов может существенно искажать наблюдаемую картину, исключая возможность получения точных количественных данных, их последующей корректной интерпретации и, как следствие, приводить к неправильным выводам и ошибкам Кочетов Г. А., . Только получение биологических макромолекул белки, нуклеиновые кислоты в чистом виде позволило перейти к изучению особенностей их строения, структурной организации молекулы и активного центра, важных функциональных групп, механизма действия и регуляции. В свою очередь, это способствовало в целом пониманию роли и тонких механизмов функционирования многих биополимеров на уровне сложноорганизованных биологических систем, включая организм человека. С практической точки зрения использование биологических макромолекул в различных отраслях медицине, фармакологии, пищевой промышленности связано с необходимостью получения их высокоочищенных препаратов. Спектр методов и технологических приемов, применяемых в современной белковой химии для сепарации и очистки биологических макромолекул и, в частности белков, весьма широк, но стратегия их выделения из самых разных источников в целом остается общей. Выбор объекта и сбор или культивирование исходной биомассы. Переработка сырья с целью получения исходного препарата экстракт, гомогенат, содержащего искомый белок, и очистка его от нерастворимых механических примесей. Предварительное грубое фракционирование для получения белковой фракции, обогащенной выделяемым белком. Применение методов колоночной хроматографии для получения конечного целевого продукта высокой степени чистоты. С академической точки зрения выбор объекта исследования определяется чисто научными интересами, которые преследует экспериментатор.