Хроматографическая очистка гидролитических ферментов из поджелудочной железы

• Автор: Царенко, Ольга Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 125 с. : ил.

Содержание
Введение.

1. Литературный обзор

1.1. Ферменты поджелудочной железы. Свойства и применение

в медицине.
1.2. Основные физикохимические методы, используемые для выделения и очистки фермеито в.

1.3. Хроматографические методы очистки белков

1.3.1. Полимерные носители для хроматографии

1.3.2. Виды хроматографических процессов. Ионообменная и гидрофобная хроматография

1.4. Термодинамический и кинетикодинамический анализ сорбциоикшых процессов. Оптимизация хроматографического разделения БАВ.

2. Экспериментальная часть.а

2.1. Объекты исследования.
2.1.1. Структура и свойства панкреатических ферментов.
2.1.2. Физикохимические характеристики сорбентов.
2.2. Методы исследования
2.2.1. Определение концентрации белка по методу Лоури.
2.2.2. Метод определения углеводов
2.2.3. Определение активности ДНКазы.
2.2.4. Метод определения активности РНКазьг
2.2.5. Определение иротеолитической активности
2.2.6. Гельхроматографичсский анализ
2.3. Методики проведения сорбционных экспериментов
2.3.1 Исследование сорбции белков в статических условиях зависимость
и изотермические процессы сорбции
2.3.2. Исследование кинетики сорбции белков.
2.3.3. Проведение процесса сорбции и десорбции в динамических условиях
2.4. Математические методы обработки результатов
3. Результаты и их обсуждение.
3.1. Изучение равновесных и кинетических параметров сорбции панкреатических ферментов на различных хроматографических носителях
3.1.1. Сорбция панкреатических ферментов на ионогенных и молекулярных сорбентах с модифицированной и немодифициронанной поверхностью
3.1.2. Сорбция панкреатических ферментов на сверхсшитых полистирольных сорбентах Стиросорб
3.2. Исследование динамических процессов сорбции и десорбции.
3.2.1. Теоретический анализ условий оптимизации. Изучение влияния скорости подвижной фазы на процесс сорбции ферментов из многокомпонентной смеси
3.2.2. Изучение сорбции ферментов из эксзракта поджелудочной железы на сорбентах с модифицированной поверхностью
3.2.3. Изучение сорбции и десорбции ферментов в динамических условиях на сверхсшитых сорбентах Стиросорб.
3.3. Масштабирование хроматографического способа очистки РНКазы
Список литературы


В медицине применяется препарат панкреатической РНКазы, который в комплексе с препаратами протеолитических ферментов и ДНКазы эффективен при лечении гнойновоспалительных процессов различной локализации 7. В литературе имеются данные об антивирусной активности панкреатической IIазы в отношении ряда РНК и ДНКсодержаших вирусов ,, а также об их применении в клинике дтя лечения вирусных заболеваний ,2, в частности, РНКсодержащих вирусов энцефалита , полиомиелита, паротита, одного из вирусов гепатита, некоторых из энтсровирусов. Установлено действие малых доз панкреатической РНКазы как стимулятора иммуногенеза РНКаза стимулирует нсспецифичсскую резистентность организма, вызывая увеличение общего белка, РНКазной активности и титра интерферона в сыворотке крови опытных животных . Широкая область применения IIазы при различных видах патологии говорит о неспе1шфичности эффекта действия фермента, обусловленного регуляцией биосинтеза белка в патологически измененных органах и гканях. На основании этого было исследовано влияние панкреатической РНКазы на течение патологического процесса в самой поджелудочной железе при ее воспалении , в результате которого происходит активация собственных протеолитических ферментов железы и нарушение процессов биосинтеза белка. Панкреатическая РНКаза, введенная внутривенно на ранних этапах острого панкреатита в дозе 23 мгкг веса, стабилизирует нарушенные биосинтетические процессы в поджелудочной железе, причем нормализация показателей акгивносги биосинтетических процессов наступает приблизительно через 1 час после введения препарата ,. Очевидно, что для использования препарата РНКазы путем внутримышечного и, в особенности, внутривенного введения степень очистки фермента должна быть очень высокой. Трипсин один из основных пищеварительных ферментов сскретируется поджелудочной железой в виде неактивного предшественника трипсиногена, относится к пептидгидролазам КФ 3. Ключевое положение трипсина в системе пищеварительных ферментов объясняется тем, что отт не только участвует в расщеплении пищевых белков, но и активирует все проферменты, образуемые в поджелудочной железе, а именно трипсиноген, химотрипсиногены А и В, прокарбоксипептидазы А и В, проэластазу, профосфолипазу. Фермент характеризуется узкой субстратной специфичностью и избирательно гидролизует связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот аргинина и лизина. Активность трипсина угнетается большим числом природных белковых ингибиторов, называемых иногда антитрипсинами, которые присутствуют в тканях животных, растений, микроорганизмов и предохраняют их от разрушения трипсином ,. В поджелудочной железе содержится два ингибитора трипсина, один из которых секретируегся в двенадцатиперстную кишку вместе с трипсином и предохраняет его от преждевременной активации. Химотрипсиц также как и трипсин, относится к пептидгидролазам и еекретируется поджелудочной железой в виде неактивного предшественника химотрипсиногена. Структу ра и свойства трипсина и химотрипсина хорошо изучены. В отличие от активации трипсиногена, образование химотрипсина из его предшественника протекает довольно сложно. Процессы, ведущие к образованию группы ахимотрипсинов из химотрипсина А, представляют собой сложную последовательность реакций, детальное описание которых представлено в литературе 7. Химотрипсин обладает более широкой специфичностью, чем трипсин легко расщепляет пептидные, амидные и сложноэфирные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы ароматических аминокислот. Тринсиногсн превращается в трипсин в кишечнике под влиянием фермента энтерокиназы, а также самого трипсина. Химическое превращение в ходе активации сводится к гидролизу одной пептидной связи и освобождению Кконцевого гексопепгида. При снижении трипсин испытывает последовательные обратимые переходы 1рбПрТ I 7 8,0, ферментативной активностью обладают формы I и М . Молекулы трипсина способны к ассоциации, которая возникает даже в лиофильно высушенных препаратах.