Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного назначения

• Автор: Гавриков, Алексей Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Оптимизация экспрессии гетерологичных белков в ii i

1.2. Создание штаммовпродуцентов интерферона альфа2Ь на основе ii i и их ферментационное культивирование

1.3. Выделение и очистка интерферона альфа2Ь

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы

2.2.1. Генноинжеиерные методики

2.2.2. Ферментационное культивирование в 2х л ферментере
2.2.3. Ферментационное культивирование в и л ферментере
2.2.4. Получение телец включения.
2.2.5. Получение грубого экстракта интерферона.
2.2.6. Очистка интерферона на катионите .
2.2.7. Очистка интерферона с использованием ОФВЭЖХ
2.2.8. Аналитические методы
2.2.8.1. Измерение концентрации белка.
2.2.8.2. Постановка белкового электрофореза.
2.2.8.3. ВЭЖХ.
2.2.8.4. Метод молекулярной гибридизации на остаточную ДНК штаммахозянна и вектора
2.2.8.5. Метод ИФА на остаточные белки штаммаиродуцента.
2.2.5.6. Метод биологического тестирования активности интерферона.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследования влияния различных факторов на уровень экспрессии альфа интерферона под контролем регуляторных
элементов Т7экспрессионнон системы.
3.1.1. Создание вариантов гена человеческого альфа интерферона с различными заменами редко
встречающихся кодонов и их клонирование в векторную
плазмиду рЕТЬ
3.1.2. Влияние тандема терминаторов транскрипции в 3иетранслируемой области гена.
3.2. Создание и ферментационное культивирование штаммапродуцента альфа2Ь интерферона.
3.2.1. Создание штаммапродуцента человеческого
рекомбинантного интерферона альфа2Ь
3.2.2. Подбор условий культивирования на лабораторном 2х л ферментере i
3 Масштабирование ферментационного процесса на промышленном и л ферментере ii.
3.3. Создание технологии выделения и очистки человеческого рекомбинантного интерферона альфа2Ь
3.3.1. Получение грубого экстракта нативного мономера интерферона
3.3.2. Хроматография на катионите 0С.
3 Хроматография на полу препаративном ОФВЭЖХ,
Заключение
Список литературы


Был разработан ферментационный протокол культивирования штаммапродуцента интерферона альфа2Ь, в котором индукция синтеза интерферона осуществляется лактозой, вместо ИПТГ. Подобный подход значительно снижает себестоимость процесса ферментации. А так же позволяет получать больше количества продукта. Было показано, что за счет оптимизации ферментационного процесса культивирования можно получать полупродукт более высокого качества, что позволяет упростить дальнейший процесс очистки интерферона, уменьшив количество хроматографических стадий, т. Разработанные технологии позволили наладить рентабельное производство субстанции интерферона альфа2Ь на базе предприятия ЗАО Мосагроген, Москва. Получаемая субстанция интерферона альфа2Ь используется для приготовления ветеринарных лекарственных препаратов Миксоферон и Кинорон. Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы в отечественных журналах и одно тезисное сообщение в материалах научных конференций. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы. Работа изложена на 2 страницах, включая рисунков и таблиц. Список цитируемой литературы содержит 8 источников, в том числе на русском языке. Общая характеристика работы. С развитием молекулярной биологии и ряда ее методических приложений генноинженерных методик и методов жидкостной хроматографии повышаются требования качества к продуктам, получаемым в данной области. Одним из основных примеров подобных тенденций является повышение чистоты фармакологических субстанций, полученных с использованием технологий рекомбинантных ДНК. Более конкретно это относится к белку, лекарственные препараты которого существуют уже более и лет, человеческому рекомбинантному интерферону альфа2Ь. Одним из основных подходов к созданию новых промышленных продуцентов биологически активных соединений является обеспечение экспрессии гетерологичной генетической информации в клетках микроорганизмов. В настоящее время наиболее изученной и потому представляющей как теоретический, так и практический интерес попрежнему остается система Е. И. Разработанные методы достижения эффективной экспрессии генов в клетках этих бактерий во многом имеют практическое значение применительно и к другим организмам. Для экспрессии клонированного гена в Е. РНК и белкового продукта. В ряде случаев задача оптимизации экспрессии этим и ограничивается. Способы стабилизации штаммов определяются конкретными задачами биотехнологического производства и свойствами клонированных генов или оперонов. Наиболее выгодным экономически является использование штаммовпродуценгов, в которых экспрессия целевого белка увеличена до количеств, измеряемых в процентах от суммарного клеточного белка в этих случаях гетерологичный белок складируется в клетке в виде нерастворимых конгломератов телец включения. Создание подобных штаммовпродуцентов возможно только при соблюдении ряда условий. Для обеспечения высокого уровня синтеза белка в клетках . Необходима оптимизация следующих критериев стабильность мРНК, эффективность трансляции мРНК, ограниченность протеолиза продукта, а так же скоординированное включение аминокислот, правильность сворачивания белка и требования к пост трансляциошюй модификации продукта, такие как протеолитический процессинг или фосфорелирование 1. Одним из факторов стабильности мРНК и эффекпгвности ее трансляции, является кодоновая композиция гетерологичного рекомбинантного гена. Отличия во встречаемости тех или иных кодонов в разных организмах довольно значительны и являются частью эволюционного процесса общей регуляции экспрессии генов в данных организмах. Например, крайне редко встречающиеся в Е. , кстати, они являются часто встречаемыми для Я. . i. Подобных кодонов в . , АТА Не ССС СТА , . При наличие редко встречающихся кодонов в гене, кодирующем гетерологичный белок, в гене, клонированном на мультикопийный экспрессионный вектор, подобная генетическая конструкция будет не жизнеспособна или же синтез целевого белка будет крайне низким, в виду созданной нестабильности мРНК.