Разработка технологии получения препарата литических ферментов, расщепляющих клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов, с использованием мутантного штамма Streptomyces griseinus 11-84

• Автор: Петрова, Наталья Тихоновна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 212 с.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ферментативный лизис микробной клеточной стенки

2. Микроорганизмы продуценты литических ферментов

3. Пути увеличения биосинтеза литических ферментов.

3.1. Получение активных штаммовпродуцентов

3.2. Метаболическая регуляция биосинтеза литических ферментов

3.3. Влияние состава питательной среды на биосинтез ферментов

3.4. Влияние условий культивирования на биосинтез литических ферментов актиномицетами.

4. Способы получения препаратов литических ферментов.

5. Области применения литических ферментов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Методы получения штаммапродуцента литических ферментов.
2. Питательные среды.
3. Математические методы планирования эксперимента.
4. Методы выращивания культуры.
5. Получение препарата литических ферментов
5.1. Мембранные методы очистки и концентрирования
5.2. Выделение препарата из концентрата
5.3. Сушка препарата
6. Методы, использованные при определении свойств препарата
6.1. Методы определения активности ферментов.
6.2. Изучение некоторых свойств препарата Лизофунгин.
6.2.1. Определение оптимальных условий действия литических ферментов
6.2.2. Определение действия препарата на микроорганизмы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1. Получение мутантного штамма.
1.1. Естественная изменчивость продуцента
1.2. Получение мутантного штамма ii
1.3. Сравнительная характеристика исходного и мутантного штаммов
Глава 2. Разработка оптимального состава питательной среды .
2.1. Влияние специфических субстратов на биосинтез литических ферментов мутантным штаммом . ii .
2.2. Влияние биомассы микроорганизмов в питательной среде на биосин тез литических ферментов .
2.3. Оптимизация состава питательной среды с использованием методов
математического планирования эксперимента
Глава 3. Разработка рациональных режимов глубинного культивирования 4 . ii .
3.1. Влияние посевного материала на биосинтез литических ферментов
3.1.1. Отработка условий поддержания штамма в активном состоянии
3.1.2. Исследование влияния количества и возраста мицелиальной посев 6 ной культуры на биосинтез литических ферментов.
3.1.3. Хранение культуры на сыпучих зерновых субстратах
3.2. Влияние начального среды на биосинтез литических ферментов.
3.3. Влияние температуры культивирования.
3.4. Зависимость образования литических ферментов от аэрирования пи 3 тательной среды.
3.5. Динамика биосинтеза ферментов литического комплекса.
Глава 4. Разработка условий выделения препарата литических ферментов
4.1. Изучение стабильности литических ферментов в фугате культураль 4 ной жидкости.
4.2. Изучение процесса очистки и концентрирования литических фермен
тов методом ультрафильтрации.
4.2.1. Выбор ультрафильтрационных мембран
4.2.2. Влияние предварительной очистки культуральной жидкости на 9 скорость ультрафильтрации
4.2.3. Влияние фугата на процесс ультрафильтрации
4.2.4. Исследование оптимальной степени концентрирования фугата 2 культуральной жидкости.
4.3. Разработка условий осаждения комплекса литических ферментов из 5 концентрата и получение препарата
4.3.1. Влияние концентрата на осаждение литических ферментов
4.3.2. Влияние концентрации этанола на литическую активность препарата
4.4. Испытание технологии получения препарата.
4.5. Описание технологической схемы получения препарата Лизофунгин 9 Глава 5. Изучение некоторых свойств препарата.
5.1. Оптимальные условия действия препарата.
5.2. Влияния солей некоторых металлов на литическую активность препарата
5.3. Характеристика ферментного комплекса препарата Лизофунгин
5.4. Изучение спектра действия Лизофунгина на микроорганизмы
Г лава 6. Области применения препарата
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Способность к биосинтезу ферментов, лизирующих микробные клеточные стенки, широко распространена среди микроорганизмов. Обнаружено и описано большое количество индивидуальных ферментов и ферментных комплексов различной субстратной специфичности, синтезируемых микроорганизмами разных таксономических групп бактериями, грибами и актиномицетами. Павлова. Кислухина и др. Viv . Маркович, Кононова, . Вследствие некоторого сходства строения клеточных стенок грибов и дрожжей, ферментные комплексы, разрушающие их, часто объединяют в одну группу. Литические ферменты, активно лизирующие микроскопические грибы и дрожжи, часто слабее действуют на бактериальные клеточные стенки, и наоборот, ферментные системы, специфичные к бактериальным клеточным стенкам, не активны по отношению к микроорганизмам других таксономических групп. Для миколитических ферментов и ферментов, визирующих дрожжи, подобной классификации не существует, но, с некоторыми изменениями, такого рода подразделение может быть применено и к этим группам литнческих ферментов. Существует также классификация литических ферментов, основанная на сходстве аминокислотных последовательностей ферментных белков, классификация, основанная на сходстве строения белковых молекул и механизма каталитического действия V , ii, . Автолитические и фагонаведенные ферменты, как правило, нестабильны вне клеток, и выделение таких препаратов технологически затруднено. Правда, в последнее время опубликован ряд работ, описывающих эти группы ферментов, специфичные по отношению к определенным микроорганизмам. Например, автолитическая ЫацетилмурамоилЬаланинамидаза из i успешно применяется для лечения пневмококковой инфекции, вызванной этой культурой , , . Еще один литический препарат из , индуцированный фагом i 6, охарактеризован как эндопепетидаза, разрушающая клеточные стенки грамположительных бактерий , , . Бактериолитические ферменты чаще, чем другие типы литических ферментов, привлекают внимание исследователей и являются наиболее изученной группой. Согласно литературным данным, в качестве продуцентов бактериолитических ферментов используются следующие микроорганизмы бактерии, например i iii i . Большинство работ по л изоферментам, имеющиеся в литературе, посвящено выделению и изучению группы бактериолитических ферментов. Значительно меньше статей по исследованию внеклеточных литических ферментов, катализирующих разрушение клеточных стенок микроскопических грибов и дрожжей. Среди продуцентов мико и дрожжелитических ферментов встречаются бактерии, например i vi i . Емцева, Коновалов, Кислухина, . Яковлева, , . Старостина и др. I . Образцова и др. Viii i Халмурадов и др. Т. i, Т. Т. vi . Маркович, Кононова, и другие культуры. Многие авторы отмечают, что среди актиномицетов часто встречаются продуценты лизоферментов. По данным Тиуновой с соавторами , все 0 проверенных актиномицетов обладали способностью синтезировать ферменты, разрушающие клеточную стенку дрожжей. Наиболее активные продуценты представители родов и i. Старостина Н. Г. с соавторами описали новые дрожжелитические препараты из культур актиномицетов. В результате скрининга из 0 культур отобрано два штамма актиномицета . ВКМ Ас и i . ВКМ Ас , лизирующих живые дрожжевые тесткультуры vii и i . Патарая Д. Т. с сотрудниками , методом агаровых блоков изучали 0 штаммов различных представителей порядка i на способность синтезировать литические ферменты и установили, что актиномицеты рода и i являются активными продуцентами литических ферментов. Из исследованных актиномицетов лизируют клеточные стенки дрожжей, клеточные стенки бактерий, действуют на хитин. Две культуры синтезировали комплекс фермеIпов, гидролизующих клетки дрожжей, бактерий и микроорганизмов, входящих в состав активного ила очистных сооружений, а также коллоидный хитин Патарая и др. Кудухашвили и др. Микроорганизмы продуценты литических ферментов относятся в основном к наиболее распространенной группе мезофильных микроорганизмов, но способность к биосинтезу лизоферментов встречается также у термотолерантных и термофильных микроорганизмов.