Конструирование диагностических иммуносорбентов с использованием искусственных аналогов трепонемных антигенов

• Автор: Голованова, Елена Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 160 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Антигенная структура возбудителя сифилиса

1.2. Современные методы диагностики сифилиса .

1.3. Проблемы и перспективы совершенствования диагностики сифилиса

1.4. Агглютинационные методы диагностики

1.4.1. Реакция пассивной гемагглютинации.

1.4.2. Реакция агглютинации латекса

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Характеристика искусственных аналогов трепонемных антигенов

2.2. Характеристика эритроцитов и методы их стабилизации.

2.3. Характеристика латексных микросфер
2.4. Панель контрольных сывороток
2.5. Определение концентрации белка метод Лоури
2.6. Иммунофермеитный анализ.
2.7. Метод сенсибилизации эритроцитов
2.8. Методы сенсибилизации латексов.
2.9. Реакция пассивной гемагглютинации.
2 Реакция агглютинации латекса.
2 Методы статистической обработки результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ АНАЛОГОВ ТРЕПОНЕМНЫХ АНТИГЕНОВ В ИФА.
1.1. Сравнительный анализ иммунореактивности синтетических пепгидов
1.2. Изучение диагностических возможностей комплексного иммуносорбента на основе комбинации синтетических пептидов из антигеню й области кДа.
1.3. Оптимизация комплексной сорбции синтетических антигенных налогов i , i , i и i антигенные области и
лава 4. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУ МА
1.1. Конструирование эритроцитарного диагностикума на основе ресомбинантных белков
1.2. Конструирование эритроцитарного диагностикума на основе синтетических пептидов.
1.3. Оптимизация условий проведения РИГА.
1.4. Сравнительная оценка диагностической эффективности полученшх препаратов
1.5. Оценка стабильности диагностикумов
лава 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА .1. Конструирование латексного диагностикума на основе рскомби
антньх белков
.2. Конструирование латексного диагностикума на основе синтети
сских пептидов
.З. Оптимизация условий проведения РАЛ
.4. Сравнительная оценка диагностической эффективности получениях препаратов
.5. Оценка стабильности диагностикумов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ПИСОК ИСГОЛЬЗОВЛНЮЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1РИЛОЖЕНИЕ.
ЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1 альдегидмодифицированный латекс
ББ боратный буферный раствор
БСА бычий сывороточный альбумин
ИФА иммуноферментный анализ
КБК карбонатнобикарбонатный буферный раствор
КлАг кардиолипиновый антиген
КМЛ карбоксимодифицированный латекс
КСР комплекс серологических реакций
МР микрореакция преципитации
НКС нормальная кроличья сыворотка
ОГ1 оптическая плотность
ОФД ортофенилендиамин
ПЦР полимеразная цепная реакция
РАЛ реакция агглютинации латекса
РИА радиоиммунный анализ
РИТ реакция иммобилизации бледных трепонем
РИФ реакция иммунофлюоресценции
РИГА реакция пассивной гемагглютинации
РСК реакция связывания комплемента
ТрАг трепонемный антиген
ФБ фосфатный буферный раствор
ФСБ фосфатносолевой буферный раствор
I А i см. ИФА
коэффициент позитивности
полистирол
сополимер полистирола и акриламида
iii водорастворимый карбодиимид
ВВЕДЕНИЕ


В плане диагностической информативности наибольшее внимание заслужили на сегодняшний день четыре основных низкомолекулярных белка полипептиды с молекулярными массами , , и кДг что было доказано их практическим применением в серодиагностике сифилиса, базирующейся на методе иммуноферментного анализа I 1,5. Таблиця 1. Спектр полипептидов, вызывающих выработку патогенепеинфичсскмх анн. VI 9. Пе риод Молекулярная масса пояипепидов, кДа Чис ло ПОЛИ пеп ти дов
Пер вич ный 4 4 4 4У 4. Ла тент ный 4 4 4. А 4 4. Трс тич имй 4 4 4 4. В таблице приняты следующие обозначения лл степени рс. В частности, регистрация антител к Трр молекулярная масса кДа позволяет подтвердить диагноз раннего первичного и врожденного сифилиса 4,9,3. На стадии вторичного сифилиса наблюдается наиболее активный синтез антител к мембранному белку Трр кДа ,. Кроме того, имеются данные о том, что этот белок наряду с белком кДа может с успехом использоваться при дифференциации сифилиса и болезни Лайма , а также сифилиса и других трепанематозов 1 . Белковый антиген Трр или ТшрАлипопротеин широко применяется в диагностической практике 9. После терапии титр антител к этому белку снижается в течение года, что позволяет проводить мониторинг успешности лечения сифилиса. Имеются также данные о присутствии в исследуемом материале антител к антигену Трр только в тех случаях, когда в организме присутствует сам возбудитель. Этот факт предполагает возможность использования этого антигена при диагностике случаев серорезистентности 8. Антиген к Да широко представленный в мембране возбудителя сифилиса интегральный белок и доминантный иммуноген высокой специфичности 6,6. Трр, или пеншдиллинсвязывающий белок, вызывает продукцию антител в первичном и, особенно, вторичном периоде сифилиса. Определение антител к этому антигену особенно важно у пациентов с ВИЧинфекцией, сочетающейся с сифилисом ,,4. Многие авторы указываю на необходимость комплексного использования в диагностике нескольких антигенных фракций для достижения наилучших показателей клинической чувствительности, охватывающей различные стад формы сифилиса 9,6,8. Однако получение и очистка природных антигенных белков включают многие трудоемкие этапы, такие как наработка патогенного материала в тканях
зараженного животного и дальнейшее выделение заданных антигенных фракций 8. Кроме того, не удается достичь достаточно хорошей степени очистки получаемых фракций, исключающей присутствие других структурных белков микроорганизма наряду с извлекаемым целевым иммуногенным белком. После работ по изучению генома Т. Наработка рекомбинантых копий аминокислотных последовательностей естественных антигенных белков с использованием данной технологии значительно более простая задача. Генноинженерные белки, полученные методом молекулярного клонирования при культивировании клетокпродуцентов . ДНК, несут в себе фрагмент антигенного белка возбудителя сифилиса ,1. Вначале вирулентный штамм i i размножают в ткани яичка кролика. Затем из биомассы спирохет извлекают ДНК, фрагментируют ее с помощью iрестриктазы, фракционируют перевар в градиенте плотности сахарозы и выделяют компоненты кбаз, которые после очистки конъюгируют с ДНК векторного фага 4 и вводят в реципиентный штамм . Последующий анализ полученных вариантов позволяет выделить среди них такой, который включает определенный генокомплекс, кодирующий синтез иммунодоминантного белка идентичного выделенному от спирохет штамма i . Таким образом были получены искусственные рекомбинантные аналоги основных трепонемных диагностически значимых белков, которые хорошо зарекомендовали себя в различных вариантах твердофазного анализа ,,7,0. Несмотря на явные преимущества генноинженерный подход не дает возможности получения в полной мере идентичных аналогов трепонемных белков, поскольку рекомбинантные молекулы наряду с фрагментом трепонемного антигенного белка содержат также и неспецифическую часть белок микроорганизмапродуцента, что приводит к снижению диагностической эффективности рекомбинантного белка в целом 9,9.