Теоретические и прикладные аспекты конструирования магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем для экспресс-диагностики вирусного гепатита A, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей

• Автор: Василенко, Надежда Филипповна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Ставрополь
• Количество страниц: 288 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. роблема вирусного гепатита А и его лабораторная диагностика.

1.2. Анализ лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки и детекции ее возбудителя

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2 1. Объекты исследования, взятые в работу

2.2. Биологическое сырье и основные химические реактивы.

2.3. Аппаратное оснащение исследований

2 4. Экспериментальные и коммерческие тестсистемы для диагностики вирусного гепатита А и Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей
2.5. Характеристика основных реагентов, используемых
для получения магноиммуносорбентов .
2.6. Методы контроля антигенов и сывороток
2.7. Методы выделения иммуноглобулинов
2.8. Получение иммуноферментных конъюгатов и контроль
их активности.
2.9. Физикохимические методы
2 Лиофилизация биологического материала
2 Методы математической и статистической обработки получен ны х резул ьтато в.
Глава 3. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТСИСТЕМЫ МАГНОИММУНОСОРБЕНТНОЙ ГЕПАТИТНОЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССДИАГНОСТИКИ В ИФА.
3.1. Разработка биотехнологии получения полиакриламидного магнитного сорбента.
3.1.1. Подбор методов выделения иммуноглобулинов класса О
3.1.2. Получение полиакриламидных гепатитных магноиммуносорбентов.
3.1.3. Технические устройства и методические приемы для работы с МИС
3.1.4. Проведение нммуноферментного анализа
3.1.5. Применение гепатитной магнонммуносорбептной полиакриламидной тестсистемы .
3 .2. Получение и применение гепатитных композиционных
магноиммуносорбснтов ГКМИС
3.2.1. Разработка биотехнологии получения гепатитных композиционных магноиммуносорбентов.
3.2.2. Характеристика гепатитного диагностикума на основе композиционных магноиммуносорбентов и его применение.
Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ИФА И ПЦР ПРИ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ НА КРЫМСКУЮ ГЕМОРРАГИЧЕСКУЮ ЛИХОРАДКУ КЛИНИЧЕСКОГО И ПОЛЕВОГО МАТЕРИАЛА, РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ ИХ КОМПЛЕКСНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
4.1. Разработка методов подготовки клинического и полевого материала для проведения исследований
4.2. Разработка методологии комплексного использования ИФА и ОТПЦР при диагностике Крымской геморрагической лихорадки.
4 .3. Разработка методов детекции вируса Крымской геморрагической лихорадки в полевом материале, полученном из природных очагов некоторых регионов Юга России
4 4. Серологическое исследование крови и органов млекопитающих и птиц в природном очаге КГ Л Ставропольского края.
Глава 5. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТ СИСТЕМЫ МАГНОИММУНОСОРБЕНТНОЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССДИАГНОСТИКИ КРЫМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ В ИФА
5.1. Разработка композиционного мапюи.ммуносорбента
на основе алюмосиликата
5.2. Разработка метода селективного концентрирования на магноиммуносорбенте с последующей постановкой иммуноферментного анализа
Глава 6. РАЗРАБОТКА СОЧЕТАННОГО МЕТОДА ДЕТЕКЦИИ ВИРУСОВ ПУТЕМ СЕЛЕКТИВНОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ НА МАГНОИММУНОСОРБЕНТЕ С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ПОСТАНОВКОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ О ГПЦР
6.1. Разработка и проведете сочетатюго метода
МИС ПЦР для детекции вируса гепатита А
6.2. Разработка и проведение сочетанного метода МИС ПЦР для детекции вируса Крымской геморрагической лихорадки .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Лабораторные методы, на которых основана современная специфическая диагностика гепатита А, были разработаны с использованием последних достижений иммунохимии, химии полимеров, электронной оптики, радиометрической техники и т. Применение традиционных вирусологических приемов оказалось невозможным, поскольку при любом варианте диагностического теста должно было выявляться только прямое взаимодействие антител с ВГА при минимальных концентрациях последнего. Рассчитывать на обнаружение ВГА по его инфекционному цитопатогенному действию, как это осуществляется при выделении других вирусных агентов, не приходилось. При разработке методов преследовалась цель индикации ВГА в экскретах больного иили определения серологических признаков острой инфекции ГА, что необходимо дтя подтверждения или отрицания этиологической роли ВГА в инфекции Балаян М. С., . В диагностике гепатита А применяются следующие лабораторные методы иммуноэлеюгронная микроскопия, твердофазные радиоиммунологический и иммуноферментный методы, полимеразная цепная реакция, реакция иммунного прилипания, метод флуоресцирующих антител и реакция связывания комплемента Заражение восприимчивых обезьян в диагностических целях не оправдано i . В . ВГА Балаян М. С. с соавт. Принцип иммуноэлсктронной микроскопии ИЭМ состоит в прямой визуализации взаимодействия вируса и антител с помощью электронного микроскопа i , А. Р., ii . В простейшем виде это микропреципнтация, при которой размеры преципитатов настолько малы, что выявляются только при высоком электроннооптическом разрешении. ВГА содержащей сывороткой, выявляются по характерному венчику и сглаживанию контуров морфологических субъединиц за счет фиксированных на поверхности частицы антител. При оптимально подобранных концентрациях сыворотки в препарате преобладают отчетливо видимые иммунные агрегаты, состоящие из полных и пустых вирусных частиц, соединенных мостиками антител Балаян М. С, . Порог чувствительности метода невысок если судить по аналогии с энтеровирусами, то он эквивалентен 1 5 инфекционных доз в 1 мл i , , . Существенным преимуществом ПЭМ является возможность оценивать не только исход серологической реакции, но и , что особенно важно, идентифицировать морфологически субстрат, т е. Этот критерий принимается в расчет при окончательной трактовке результатов. При наличии препаратов ВГА с известным содержанием частиц метод ИЭМ может быть применен для количественного определения антиВГА в сыворотках. Для такой цели предложена система учета интенсивности взаимодействия вируса и антител, что, в свою очередь, отражает концентрацию ангител в препарате Анджапаридзе А. Г. с соавт. ИЭМ был первым серологическим методом, успешно использованным для обнаружения и идентификации возбудителя ГА в материале от больных Савинская С. С. с соавт. Дорошенко Н. В. с соавт. Анджапаридзе А,Г. ВГА, и других подобных задач Балаян М. С., . Одной из первых в серологических исследованиях при гепатите А стала применяться реакция иммунного прилипания РИГ1 i М. I . Иммунологический феномен, лежащий в основе РИП, состоит в образовании комплекса антигенантителокомплемент и прикреплении его к эритроцитам, сопровождающимся агглютинацией последних. Практически тест выполняется путем смешивания растворов, содержащих антитела и антиген, добавления после их инкубации комплемента, дополнительной инкубации, внесения эритроцитов человека 0 группы и, наконец, наблюдения за исходом реакции Балаян М. С., . При использовании РИП для индикации ВГА и антиВГА имеются существенные методические трудности высокая степень очистки и концентрации ВГА принадлежность эритроцитов к группе 0 человека не означает, что они будут пригодны для реакции требуется дополнительная стабилизация комплемента i . Первое условие практически не может быть соблюдено при исследовании экскретов больных на содержание ВГА, поэтому РИП использовали преимущественно как метод обнаружения и титрования ВГА. Ввиду недостаточно высокой чувствительности РИП результаты, полученные в сероэпидемиологических наблюдениях за состоянием иммунитета, оказались несопоставимыми с результатами более чувствительных методов ii . В первые годы изучения ВГА . РСК.