Изучение регенерации и создание векторной конструкции для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.)

• Автор: Гхасеми Безди Камал
• Шифр специальности: 03.00.23, 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И

ГЛАВА 1. Молекулярногенетические механизмы агробактериальной трансформации.

1.1. Плазмиды агробактерий и опухолеобразоваиие у высших растений

1.2. Процесс переноса ТДНК из агробактерии в растительную клетку .

1.3. Конструирование бактериальных векторов для введения генов в

растения.

1.3.1. Создание вектора на основе Тьплазмиды.

1.3.2. Векторы для трансформации растений на основе Тьплазмиды

1.3.3 Маркры трансформации.
1.3.3.1. Селективные маркеры.
1.3.3.2. Репортрные гены
1.3.4. Промоторы.
ГЛАВА 2. Антимикробные белки и их использование для защиты растений
2.1. Классификация антимикробных белков
2.2. Растительные дефензины
2.3. Антимикробные свойства растительных дефензинов
2.4. Трансгенные растения с генами антимикробных белков, устойчивые
к грибным патогенам
2.5. Очистка и экспрессия антимикробного белка М1АМР1
ГЛАВА 3. Регенерация из соматических тканей растений
3.1. Регенерации рода i.
3.2. Регенерация рапса.
3.2.1. Выбор экспланта рапса.
3.2.2. Роль фитогормонов в среде для регенерации рапса.
ГЛАВА 4. Генетическая трансформация представителей рода i с помощью i i
4.1. Метод кокультивирования с агробактерией.
4.2. Факторы, влияющие на агробакгериальную трансформацию представителей рода i.
РАЗДЕЛ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. Объекты, условия и методы проведения исследований.
5.1. Клонирование
5.1.1. Место исследования
5.1.2. Бактериальные штаммы, плазмиды и используемые среды для
выращивания бактерий
5.1.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК .i.
5.1.4. Конструирование растительного вектора.
5.1.5. Трансформация агробактериального штамма 0 плазмидной
ДНК I.1i
5.1.6. Наращивание и приготовление агробактериального газона.
5.1.7. Проверка наличия рекомбинантных ДНК в агробактерии
5.1.8. Проверка наличия vгенов в трансформируемом штамме
агробактерии
5.1.9. Анализ клонированного гена
5.1 Культивирование и хранение бактериальных штаммов
5.2. Культивирование i vi и оптимизация условий регенерации рапса .
5.2.1. Растительный материал.
5.2.2. Условия культивирования.
5.2.3. Подбор и приготовление питательных сред.
5.2.4. Введение в культуру i vi
5.2.5. Выбор экспланта рапса.
5.2.6. Укоренение регенераитов в среде i vi
5.2.7. Математическая обработка
5.3. Агробактериальная трансформация рапса.
5.3.1. Подготовка эксплантов рапса к трансформации.
5.3.2. Получение ночной культуры агробактерии
5.3.3. Инокуляция экспланта аробактерией
5.3.4. Получение трансформапгов рапса
5.4. Методы анализа растенийтрансформантов
5.4.1. Гистологическая окраска .
5.4.2. Выделение растительной геномной ДНК для ПЦР.
5.4.3. ПЦРанализ наличия трансгена гигромицинустойчивых растений
РАЗДЕЛ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 6. Клонирование ДНК, кодирующей ген антимикробного белка i
6.1. Создание векторной конструкции с геном i.
6.2. Трансформация генетической конструкции в агробактерию.
6.3. Проверка наличия vгенов в трансформируемом штамме
агробактсрии.
ГЛАВА 7. Оптимизация условий регенерации рапса
7.1. Оценка растительного материала на интенсивность морфогенеза в
культуре i vi
7.2. Влияние состава питательной среды на формирование адвентивных
почек рапса в условиях i vi
7.3. Влияние АБК на побегообразование эксплантов рапса
7.4. Сравнение питательных сред 5 и 9 на адвентивный морфогенез
рапса сорта в условиях i vi.
7.5. Влияние фитогормонов на витрификацию растенийрегенерантов
рапса.
ГЛАВА 8. Трансформация растений рапса геном антимикробного белка i.
8.1. Влияние антибиотиков на экспланты нетрансформированных
растений
8.2. Определение эффективности трансформации рапса при помощи
созданной векторной конструкции с геном i
8.3. Анализ первичных трансформантов рапса.
8.4. Определение экспрессии гена глюкуронидазы .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поэтому экспрессия в них генов антимикробных белков, особеннообладающих более высокой физиологической активностью пептидов из других растений, должна способствовать появлению необходимой устойчивости к патогенам у всего растения. Актуальность нашего исследования определялась тем, что рапс i . Канаде, Китае, Европейских странах, Индии, и в других странах мира. В Иране ежегодно увеличивается площадь под посевами рапса. В году в Иране объем производства рапса на площади ,0 га был 8,0 т. Один из главных факторов, ограничивающих возделывание этой культуры его восприимчивость к склеротинии ii i причинный агент белой болезни гнили. Применение фунгицидов не очень эффективно для устранения симптомов вызванных этой болезнью. Дополнительно применение фунгицидов увеличивает стоимость производства и может оказывать неблагоприятное влияние на окружающую среду. Поэтому идентификация генов для создания устойчивого рапса методами генной инженерии обеспечивает привлекательную альтернативу для улучшения устойчивости к этой болезни . Ускорить решение данной проблемы можно при помощи методов генной инженерии. Австралии в университете Квинсленда. Они полагали, что ген, кодирующий этот белок, может быть использован для генетической манипуляции с целью увеличения устойчивости к болезням в трансгенных растениях. В связи с вышеизложенным, настоящая работа посвящена анализу полученных при помощи ПЦР амплификации в Центре молекулярной биотехнологии РГАУМСХА имени К. А.Тимирязева гена i, кодирующего антимикробного белка австралийского ореха, созданию векторной конструкции с этим геном для проведения агробактериалъной трансформации иранского рапса, который отличается генетической устойчивостью к болезни склеротинии. АоЬааепит Штеааепз. Отобрать первичные трансформанты рапса. В связи с вышеизложенными, важнейший этап в создании трансгенных растений посвящен разработке эффективной методики регенерации и генетической трансформации рапса. Целью данной методики является проведение эксперимента по агробактериальной трансформации, в результате которой в геном рапса будет включен фрагмент чужеродной ДНК, содержащий ген М1АМР1, продукт которого придаст растениям рапса устойчивость к склеротинии. В работе по трансформации растений рапса применяли специальный агробактериальный штамм АСЗЬО, содержащий растительный вектор рСАМВ1А. М1АМР1 в качестве целевого гена. Метод создания трансгенных растений рапса в культуре тканей включает в себя целый ряд важных этапов выбор реципиентной системы, подбор оптимальных условий, культивирования, проведения регенерации и генетической трансформации, отбор устойчивых трансформантов рапса к антибиотику гигромицину и получение первичных трансформантов рапса. РАЗДЕЛ I. Поиски путей введения чужеродных генов в клетки высших растений интенсивно ведутся во всем мире с начала х годов. Одним из импульсов к развитию методов переноса чужеродных генов в растения стали результаты детального изучения молекулярногенетических основ опухолевого роста у растений при участии бактерий рода i. В результате этих исследований оказалось, что опухолеобразующие плазмиды агробактерий, представляющие собой миникольцевые ДНК, являются природной векторной системой, которую сейчас используют для переноса генов в растения. Изучение индуктора опухолей i i показало, что собственно опухолеродным агентом у этой бактерии является iплазмида, которая переносит часть своей ДИК в ДИК растительной клетки, в ДНК встраивается нужный ген. С помощью этого уникального вектора уже получено большое число трансгенных растений Лутова, . ГЛАВА 1. Расгительные клетки после контакта с агробактериями начинают быстро и неорганизованно расти, образуя опухоли, секретирующие особые вещества, производные аргинина, называемые опинами . Когда клетки корончатых галлов культивируют i vi, они растут при отсутствии специальных гормонов, которые необходимы при культивировании нормальных растительных клеток Лутова, . Одной из основных проблем при получении трансгенных растений был способ введения чужеродных генов в хромосомы растений т.