Получение и культурно-морфологическая характеристика кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки

• Автор: Фридман, Михаил Львович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

Содержание

Список условных сокращений.

1. Введение

2. Обзор литературы.

2.1. Культуры клеток кожи млекопитающих и история их получения

2.2. Гистологическое строение и эмбриогенез кожи млекопитающих

2.3. Методы получения и культивирования кератиноцитов млекопитающих

3. Собственные исследования.

3.1. Материалы исследований.

3.1.1. Питательные среды и растворы

3.1.2. Постоянные линии и диплоидные штаммы клеток.

3.1.3. Штаммы вирусов
3.2. Методы исследований
3.2.1. Получение первичной культуры клеток кожи
3.2.2. Подсчет концентрации клеток в суспензии.
3.2.3. Определение доли жизнеспособных клеток и подсчет индекса пролиферации.
3.2.4. Цитологические методы исследования
3.2.5. Кариологическое исследование
3.2.6. Электронномикроскопическое исследование
3.2.7. Вирусологические исследования.
3.2.8. Криоконсервирование и создание банка культур клеток.
3.3. Результаты исследований
3.3.1. Разработка оптимальных условий ферментативного разделения эпидермального и дермального слоев кожи плодов кролика, кошки, собаки.
3.3.2. Разработка оптимальных условий ферментативной дезагрегации ЭСКП кролика, кошки, собаки
3.3.3. Разработка оптимальных условий культивирования первичных культур ЭСКП кролика, кошки, собаки
3.3.4. Определение эффективности ростовых свойств питательных сред для культивирования первичных культур ЭСКП кролика, кошки, собаки .
3.3.5. Субкультивирование клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки
3.3.6. Сравнительное изучение культуральноморфологических свойств полученных культур с постоянной линией РК и диплоидным штаммом КЭК
3.3.7. Изучение динамики митотической активности в процессе длительного культивирования клеток ЭСКП кролика
3.3.8. Сравнительный кариологический анализ культуры клеток ЭСКП кролика и постоянной линии РБК.
3.3.9. Ультраструктурная характеристика состава клеточной культуры ЭСКП кролика.
3.3 Изучение влияния глубокого замораживания на жизнеспособность клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки
3.3 Изучение чувствительности культуры клеток ЭСКП кролика к вирусам
4. Обсуждение результатов исследований
5. Выводы.
Практические предложения
Список литературы


У большинства известных перевиваемых линий клеток эпидермального слоя кожи при длительном пассировании снижается чувствительность к вирусам, ухудшается пролиферативный потенциал, меняются культуральноморфологические свойства. Всегда может возникнуть потребность оперативного получения новых перевиваемых линий кератиноцитов от различных видов животных. Поэтому, представляется актуальной в научном и практическом отношениях разработка легко воспроизводимых, оперативных и унифицированных для различных видов животных методик получения культур кератиноцитов с их детальной культуральноморфологической, кариологической и ультраструктурной характеристикой. Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в получении культур кератиноцитов кожи плодов кролика, собаки, кошки, изучение их культуральноморфологических свойств и чувствительности к вирусам. Научная новизна. Получены первичные культуры и субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки с использованием различных диспергирующих агентов. Получен диплоидный штамм кератиноцитов кожи плода кролика и постоянная клеточная линия ЭККПКр. Изучены их культуральноморфологические и кариологические свойства. Представлена ультраструктурная характеристика полученных клеточных культур. Показано, что субкультуры клеток ЭСКП кролика на и пассажах, диплоидный штамм клеток ЭСКП кролика на пассаже, а также ЭККПКр обладают высокой чувствительностью к вирусу ВДБС и слабой чувствительностью к вирусу ИРТ. Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований усовершенствованы методы получения первичных культур и субкультур клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки. Получены и заложены в криобанк ВИЭВ субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки. Получен и заложен в криобанк ВИЭВ диплоидный штамм кератиноцитов кожи плода кролика и постоянная клеточная линия ЭККПКр и показана возможность их использования в вирусологических исследованиях. Разработаны и опубликованы методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки. Апробация. Международной конференции Сохранение генетических ресурсов Москва, ВИЭВ, г. Межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, 1 работа находится в печати. Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 5 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы таблицами, рисунками. Список литературы включает 5 публикаций, в том числе иностранных. Культура кожной ткани является одной из первых полученных органных культур. Еще в г. С.А. культивировал в асцитной жидкости кусочки человеческой кожи, которые переживали в течение нескольких суток. Позднее многие исследователи культивировали эксплантаты кожи, применяя различные способы. Развитие общих методов культивирования клеток способствовало совершенствованию приемов культивирования клеток кожи Гаврилюк Б. К., Рочев Ю. А., Николаева Т. Н., . Одним из первых кто добился успеха в длительном культивировании клеток кожи, сохраняющих диплоидный кариотип, были Т. Т. , . . i, . i . В качестве исходного материала они использовали кусочки кожи людей различного возраста. Два штамма из полученных удалось поддерживать на протяжении девяти месяцев. В году Т. С. и . . . 1, полученной из меланомы золотого сирийского хомячка, чувствительной к вирусу везикулярного стоматита. В году . i и . . разработали метод выделения и поддержания культур диплоидных клеток различных тканей человека и с его помощью получили штаммы I2, I5, I8, I, I, I из кожномышечной ткани эмбриона человека. Впервые в нашей стране, с использованием методики, предложенной . i и . . , I. I. Миронова, Н. Е. Гольдфарб, О. Ф. Сарычева получили из кожи и мышцы эмбриона человека диплоидные штаммы ЧЭ1, ЧЭ2 и ЧЭ3, которые были представлены фибробластоподобными клетками с высокой пролиферативной активностью.