Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента

• Автор: Гришин, Дмитрий Викторович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1. Характеристика синдрома мальабсорбции

2. Обзор методов конверсии лактозы в пищевой промышленности.

3. Общая характеристика ферментов класса гликозилгидролаз.

3.1. Общая характеристика ферментов класса 3галактозидаз

3.1.1. Мезофильные ргалакгозидазы

3. 1.2. ргалактозидазы термофильных микроорганизмов

4. Технология слитных генноинженерных конструкций в науке и практике

4.1. Общая характеристика метода

4.2. Современный взгляд на применение химерных белков.

4.2.1. i технология и биокатализ.
4.2.2. Создание рекомбинантных антител
4.2.3. Субъединичные генноинженерные вакцины.
4.2.4. Химерные белки для оптимизации аффинной хроматографии
5. Декстрансвязывающий домен и его биологические источники
6. Иммобилизованные ферменты
7. Цели и задачи работы.
Глава II. Материалы и методы
1. Материалы
1.1. Химические реагенты
1.2. Составы используемых буферов.
1.3. Бактериальные штаммы и ростовые среды для бактериальных культур
1.4. Используемые коммерческие плазмидиые векторы и синтетические олигонуклеотиды.
1.4.1. Коммерческие плазмидные векторы
1.4.2. Синтетические олигонуклеотиды
2. Методы молекулярного клонирования в басгериях.
2.1. Бактериальные штаммы и используемые среды
2.2. Клонирование плазмидной ДНК в бактериях
2.2.1. Молекулярные методы получения генноинженерных конструкций.
2.2.2.Получение компетентных клеток штаммов Е.со
2.2.2.1.Подготовка клеток к электропорации
. Проведение электропорации.
2.3. Выделение хромосомной ДНК методом фенолхлороформной
экстракци
2.4. Анализ клонированных генов.
2.5. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.6. Источники клонируемого материала.
3. Метод изоляции культур лисопоьос теьепегосез
4. Используемые методы очистки белков.
4.1. Катионообменная хроматография
4.2. Гельфильтрация.
5. Метод количественного определения белка метод Мэрион Бредфорд
Глава Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Создание бактериальных штаммов продуцентов белка ДСДсн рГАЛ.
1.1 .Создание бактериального штаммапродуцента, обеспечивающего клонирование гена и экспрессию белка ЬасХТЬЕИ.
1.2.Создание бактериального штаммапродуцента, обеспечивающего экспрессию белка ОВОС1у8ег5.
1.2.1. Получение и клонирование гена ДСД из .еисопозЮс теьепегогея
1.2.2. Получение экспрессионной плазмиды с геном ДСД из ii со спенсером на Сконце
1.2.2.1. Получение гена ДСД из i со спенсером на С конце
1.2.2.2. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка
1.2.3. Создание бактериальных продуцентов белка
1.3. Создание бактериального штаммапродуцента обеспечивающего экспрессию химерного белка ДСДспрГАЛ в цитоплазме клеток . i
1.3. 1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка ДСДспРГАЛ.
1.3.2. Секвенирование аутентичных нуклеотидных последовательностей гена белка ДСДсп АЛ
1.3.3. Создание бактериальных продуцентов гена белка ДСДспРГАЛ
2. Оптимизация условий экспрессии белка ДСДспрГАЛ.
2.1. Оптимизация времени индукции
2.2. Оптимизация количества индуктора
2.3. Оптимизация ионного состава ростовой среды
3. Изучение физикохимических свойств белковой конструкции ДСДспрГАЛ.
3.1. Анализ растворимости белка ДСДспРГАЛ в лизатах клеток . i штамма
3. 2. Изучение термостабильности белка ДСДспРГАЛ
3.3. Изучение ферментативной активности белка ДСДспрГАЛ в лизатах клеток . i штамма 5.
4. Хроматографическое выделение белка ДСДспРГАЛ и изучение его декстрансвязывающих свойств .
4.1. Определение изоэлектрической точки ДСДспрГАЛ.
4.2. Катионообменная хроматография.
4.3. Изучение декстрансвязывающих свойств целевого белка
4.4. Изучение степени очистки белка ДСДспрГАЛ посредством аффинной хроматографии на декстране
5. Сравнительная характер и сги ка влияния различных физических факторов на исследуемый белок.
6. Создание модельной системы для ферментации бетагалактозидов на базе декстрана и рекомбинантного белка ДСДспрГАЛ
Заключение
Основные результаты и выводы.
Список литературы


В современной биотехнологической практике одно из наиболее важных мест принадлежит ферментам и ферментным системам, которые широко используются в различных отраслях промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Известно, чго большинство ферментов, являясь веществами белковой природы, неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям и к воздействию различных химических реагентов. Принципиально новым подходом к получению таких препаратов как ргапактозидзы с улучшенными характеристиками является внедрение методов биотехнологии и генной инженерии. Это значительно облегчало бы процесс очистки фермента, что важно не только в свете возможности использования данного иммобилизованного на декстрапе фермента в качестве медицинского препарата, но и при оптимизации процессов конверсии лактозы в пищевой промышленности, в частности для создания безлактозных молочных продуктов 4. Получение подобных ферментных препаратов становится возможным при использовании штаммов бактерий, трансформированных плазм ид ной ДНК, несущей ген Ргалактозидазы с улучшенными свойствами 5. В настоящее же время использземые в мировой научной и промышленной практике штаммы Е. Н продуценты, экспрессируют ферменты способные быть иммобилизованными в основном только химическими методами, что, может повлечь за собой значительную инактивацию целевого белкового продукта 6. Положения, выносимые на защиту. Созданный плазмидный вектор с регуляторными областями и геном химерного белка ДСДспРГАЛ. Рекомбинантная белковая конструкция ДСДспрГАЛ содержащая декстрансвязывающий домен и каталитическую последовательность фермента термостабильной ргалактозидазы и е штаммпродуцент. Стратешя очистки рекомбинантных белков, основанная на сочетании использования. Дскстранбелковый комплекс на основе белка ДСДспрГАЛ и деке фанового сорбента для гидролиза бетагалактазидов. Научная новизна. Концепция разработки слитных генноинженерных конструкций, позволила нам создать плазм ид ный вектор с геном химерного белка и экспрессировать сам белок ДСДспрГАЛ, облачающий одновременно декстрансвязывающими свойствами и активностью фермента термостабильной Ргалактозидазы. Так же была предложена стратегия аффинной очистки рекомбинантного белка и получения дскстранбелкового комплекса на базе данного двудоменного белка, а также изучены возможности его практического использования. Практическое значение работы. Технологическая схема получения химерного белка ДСДспрГАЛ, а также способ очистки и иммобилизации данного белка на декстрановых сорбентах моуг найти применение в медицине, в качестве компонентной базы при создании комплексных препаратов для профилактики синдрома мальабсорбции недостаточности фермента лактазы. Также данный декстранбелковый комплекс может быть использован в пищевой промышленное при реализации схем получения безлактозных продуктов. Глава. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Синдром мальабсорбции СМА, вследствие своей распространенности, полиэтиологичности и тяжести проявлений, занимает особое место среди большого числа алиментарнозависимых заболеваний. Под СМА сейчас понимают комплекс клинических проявлений, обусловленных нарушениями полостного, пристеночного, мембранного пищеварения и транспорта в тонкой кишке, приводящий к глубоким сдвигам обмена веществ. Как уже было отмечено, недостаточность фермента лактазы имеет особое значение в раннем детстве, так как лактоза рОгалактопиранозил Огалактопиранозы или молочный сахар, по ныне распространенной номенклатуре углеводов относящийся к классу дисахаридов биоз, содержится в молоке, которое является основным питанием ребенка. Лактаза ГОгалактоз ид аз а синтезируется в первую очередь в энтероцитах кишечных ворсинок. Подобная топография и объясняет наиболее частое возникновение недостаточности лактазы не только на генетическом уровне, но и при систематическом повреждении слизистой оболочки тонкого кишечника 7. Следует особо отмстить, что активность лактазы максимальна у новорожденных, а в постнатальном периоде она резко уменьшается. Затем происходит дальнейшее снижение активности, и к 5 годам активность лактазы становится такой же, как у взрослых. Распространенность недостаточности лактазы среди населения варьирует в различных регионах.