Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих РНК в клетки-мишени

• Автор: Цибулькина, Елена Арнольдовна
• Шифр специальности: 03.00.23, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Доставка малых интерферирующих РНК в клеткимишени

1.1. Механизм РНКннтерференцин

1.2. Внутриклеточная интерналтзация миРНК

1.3. Вирусные системы доставки миРНК

1.3.1. Ретровирусные векторы

1.3.2. Аденовирусные векторы

1.3.3. Векторы на основе аденоассоциировапных вирусов

1.3.4. Векторы на основе вируса простого герпеса

1.3.5. Векторы на основе пара и ортомиксомирусов
1.3.6. Недостатки вирусных систем доставки препаратов
1.4. Нсвирусныс системы доставки миРНК
1.4.1. Физические методы
1.4.2. Электрохимические методы
1.4.3. Полимеры и дендримеры
1.4.4. Биодеградабельные полимеры
1.4.5. Системы доставки миРНК на основе циклодекстрана
1.4.6. Катионные липосомы
1.4.7. Пенетрирующие клетку пептиды
1.4.8. Белковые системы доставки миРНК
1.5. Биораспределсние миРНК i viv
1.6. Способы введения миРНК i viv
1.6.1. Системное введение миРНК
1.6.2. Локальное введение миРНК в органы и ткани
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Приборы и материалы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Методика приготовления ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных миРНК
2.2.2. Характеристика полученного препарата иммунолипосом
2.2.3. Исследование специфичности ПЭГилированных иммунолипосом на культуре шванновских клеток
2.2.4. Оценка эффективности иммунолипосомальной доставки миРНК в шванновские клетки
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение препарата ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных мнРНК
3.2. Харастеристика полученного препарата иммунолипосом
3.2.1. Определение размера липосом
3.2.2. Количественное определение фосфолипидов в водных эмульсиях
3.2.3. Определение общего белка с бицинхониновой кислотой
3.2.4. Определение стабильности липосом в сывороточной среде
3.2.5. Определение срока сохранности липосом
3.3. Исследование специфичности ПЭГилированных иммунолипосом на культуре шванновских клеток
3.3.1. Иммунопероксидазный анализ культуры шванновских клеток
3.3.2. Оценка специфичности связывания препарата иммунолипосом со шванновскими клетками
3.3.3. Иммунолипосомальная доставка миРНК. подавляющих синтез ОБМ, в шванновские клетки
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Важным достоинством таких транспортных средств является возможность продления их срока жизни в кровотоке посредством введения в состав липосомных мембран конъюгатов липидов с полиэтиленгликолем, т. ПЭГилирование липосом, в результате чего происходит значительное замедление системной элиминации таких стерически стабилизированных липосом Беа липосом . Специфичность липосомальных транспортных систем обусловливается наличием в их структуре векторных молекул МАТ к антигенам клегокмишеней или белкалиганда. Вектор является своего рода троянским конем он взаимодействует с клеточными мишенями белковыми и иными антигенами, рецепторами, липопротеидными комплексами и т. В частности, для селективного векторного транспорта к миелинобразующим клеткам оптимальной мишеныо представляется ОБМ. Все это дает иммунолипосомальному транспорту миРНК неоценимые преимущества по сравнению с другими системами доставки нуклеиновых кислот в шванновские клеткимишени. В свете вышеизложенного актуальность выбранной темы исследования определяется крайней необходимостью в создании иммунолипосомальных систем селективной доставки миРНК, способных подавлять синтез целевого белка в шванновских клетках. Работа является, частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ в рамках госбюджетной темы 1Б56 Исследования липидов, нуклеозидов, пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения онкологические и вирусные болезни, возрастные патологии, а также по проекту аналитической ведомственной программы Рособразования Развитие научного потенциала высшей школы, . Целыо данной работы являлось создание ПЭГилированных иммунолипосомальных систем, способных специфически связываться со шванновскими клетками и осуществлять доставку внутрь клеток миРНК, блокирующих синтез целевого белка. Оценка эффективности доставки миРНК внутрь клетокмишеней. В ходе данной работы впервые была разработана иммунолипосомальная транспортная система, способная специфически связываться со шванновскими клетками. Впервые была разработана и охарактеризована иммунолипосомальная система доставки миРНК, подавляющих синтез ОБМ в шванновских клетках. Для определения эффективности доставки миРНК в клеткимишени впервые был разработан сэндвичвариант твердофазного иммуноферментного анализа ОБМ в лизатах шванновских клеток. Результаты настоящей исследовательской работы демонстрируют высокую специфичность сконструированных иммунолипосомальных контейнеров к ОБМ, презентированному на шванновских клетках. Эго говорит о том, что разработанные ПЭГилированные иммунолипо сомы в перспективе могут найти применение в качестве препарата для диагностики заболеваний, сопровождающихся нарушением миелинизации. В ходе работы показано, что полученные иммунолипосомальные контейнеры способны селективно доставлять миРНК в нефиксированную культуру клеток, что в будущем может быть использовано при разработке терапевтических препаратов для лечения заболеваний различной генетической этиологии. С помощью разработанного нами сэндвичварианта иммуноферментного анализа ОБМ в биологических жидкостях лизаты шванновских клеток был подтвержден факт внутриклеточной доставки миРНК посредством ПЭГилировапных иммунолипосом, что вносит определенный вклад в понимание до сих пор до конца неизученных основных механизмов проникновения содержимого компартмента иммунолипосом в клеткимишени. Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины Россия, Астрахань, 8 сентября , а также на заседании кафедры биотехнологии факультета биоорганического синтеза и биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова и на заседании Проблемного совета ФГУ ГНЦССП им. В.П. Сербского. По материалам диссертации опубликовано семь научных работ, отражающих основное содержание проведенных исследований. Диссертация изложена на 5 страницах печатного текста содержит рисунков и 4 таблицы состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 5 наименований.