Исследование яда вьетнамских скорпионов с целью нахождения новых биологически активных соединений для применения в биохимии и медицине

• Автор: Хоанг Нгок Ань
• Шифр специальности: 03.00.23, 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 227 с. : ил

Введение

ГЛАВ АЛ, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Выделение токсинов из яда скорпиона

1.1.1. Выделение токсинов методом жидкостной хроматографии низкого давления

1.1.2. Выделение токсинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2. Структура и физикохимические свойства токсинов скорпионов

1.2.1. Первичная структура токсинов скорпионов

1.2.2. Пространственная структура токсинов скорпионов.

1.2.3. Физикохимические свойства токсинов скорпионов.

1.2.3.1. Токсины, действующие на Ма каналы

1.2.3.1.1. Натриевые каналы.

1.2.3.1.2. Классификация токсинов, действующих на Ыа каналы
1.2.3.1.3. Филогенетическая специфика токсинов
1.2.3.1.4. Группы токсинов
1.2.3.1.5. Функциональный анализ токсинов скорпиона, действующих на
Ыаканалы
1.2.3.2. Токсины, действующие на КГканалы
1.2.3.2.1. Классы токсинчувствительных калиевых каналов
1.2.3.2.2. Общие характеристики коротких токсинов скорпиона, действующих на К каналы
1.2.3.2.3. Токсины скорпиона, действующие на апаминчувствительный К канал.
1.2.3.2.4. Токсины подсемейства карибдотоксина
1.2.3.2.5. Токсины подсемейства ноциустоксина.
1.2.3.2.6. Токсины подсемейства калиотоксина
1.2.3.2 7. Токсин ТэКа
1.2.3.2.8. Токсины скорпиона нового типа действия на К каналы
1.2.4. Клонирование кДНК и генов, кодирующих токсины 1Ма каналов.
1.2.5. Вывод
1.3. Применение нейротоксинов скорпионов в качестве инсектицидов
1.3.1. Фармакологическая уникальность нейротоксинов скорпионов
1.3.2. Совместное действие токсинов скорпиона с химическими инсектицидами.
1.3.3. Генетический полиморфизм нейротоксинов скорпиона.
1.3.4. Функциональная экспрессия нейротоксинов скорпиона
1.3.5. Выявление биоактивной поверхности токсина скорпиона ТсЬа1Т.
1.3.6. Токсины скорпиона как будущие потенциальные биопесгициды.
ГЛАВАМ. МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
.1. Выращивание скорпионов в лаборатории
.2. Отделение яда скорпиона ВШИиэ эр. от мукопротеинов
.3. Выделение физиологически активных соединений путем гельфильрании на колонке с Сефадексом в
.4. Определение токсичности выделенных белков.
.5. Определение гемагглютинируюшей активности выделенных фракции.
.6. Определение потенциала действия.
.7. Выделение и характеристика лектина
П.8. Выделение токсинов и их характеристика.
.9. Определение первичной структуры выделенных токсинов
Пространственное строение нейротоксина М9 ВшИт еиреиз в растворе.
ГЛАВА.III. РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Ш.1. Вырашивание вьетнамского скорпиона и получение яда скорпиона
III. 1.1. Распространение скорпиона во Вьетнаме
III. 1.1.1. Скорпионы Не1еготе1ги эр. и 1ШегопШгш суапеш
III. 1.1.2. Скорпион Вшких вр
III. 1.2. Процесс размножения и развитие скорпиона ВшИш эр.
III. 1.3. Пища для скорпиона.
1.1.4. Получение яда скорпиона.
1.1.5. Физикохимические свойства яда вьетнамских скорпионов.
III. 1.6. Перспективы использования яда скорпиона ВшИж ер. в медицине III. 1.7. Выводы.
1.2. Выделение лектина из яда вьетнамского скорпиона ВШшб ер. и его характеристики.
Ш.2.1. Выделение лектина из яда скорпиона ВшИш эр
Ш.2.2. Характеристика лектина яда ВшИж Бр
1.2.3. Выводы.
Ш.З. Выделение токсинов из яда вьетнамского скорпиона ВшИи .чр. и исследование их действия на возбудимость миелинового нерва
Ш.3.1. Выделение токсинов из яда скорпиона ВиМш Бр. методом жидкостной хроматографии
1.3.2. Исследование действия токсинов Вшкт яр. на возбудимость миелинового нерва.
1.3.3. Выводы.
1.4. Первичная структура двух токсинов выделенных из яда вьетнамского скорпиона Вшгж яр
1.4.1. Первичная структура токсина , выделенного из яда вьетнамского
скорпиона Вшкиэ эр
Ш.4.2. Первичная структура токсина выделенного из яда вьетнамского
скорпиона ВшИж яр.
II 1.4.3. Выводы
Ш.5. Пространственное строение нейротоксина М9 ВиВт еиреин в растворе.
Ш.5.1. Конформационная гетерогенность молекулы М9.
1.5.2. Выделение и отнесение сигналов в спектрах доминирующего
при физиологических условиях конформера М9.
Ш.5.2.1. Выделение сигналов индивидуальных аминокислотных остатков
1.5.2.2. Отнесение сигналов индивидуальных аминокислотных остатков к
положению в первичной структуре нейротоксина М
Ш.5.2.3. Выделение и отнесение сигналов от протонов аминокислотных
остатков, имеющих протоны в уположении
II 1.5.3. Установление пространственного строения доминирующего при физиологических условиях конформера нейротоксина М
1.5.3.1. Экспериментальные данные, использованные для установления пространственного строения нейротоксина М9.
1.5.3.2. Вторичная и третичная структура доминирующего при физиологических условиях конформера нейротоксина М9по данным спектроскопии НЯМР
1.5.3.3. Сравнение конформациий скорпионовых токсинов. Связь структуры с биологической активностью
1.5.4. Выводы
Общие выводы Литература.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


РагаЬшИия КатааИсж. Таким образом, в настоящее время ВЭЖХ стала эффективным методом для изучения токсинов скорпионов с его помощью был выделен ряд гомогенных токсинов. Токсины скорпионов представляют собой семейство небольших основных нейротоксических белков, которые действуют на ионную проницаемость возбудимой клетки . Выделяют четыре различные семейства токсинов по их специфичным взаимодействиям с Ма каналами , , К каналами 1, СГ каналами , и Са каналами . В настоящее время, более изучены токсины, действующие на Ка и К каналы. Известно что, токсины, специфично действующие на Ыа каналы, состоят из аминокислотных остатков, стабилизованных четырьмя дисульфидными мостиками ,,. Кка налы, состоят из аминокислотных остатков, и стабилизованы гремя дисульфидными мостиками ,,. Новый токсин, действующий на КГканал и имеющий четыре дисульфидных мостика, был описан в г . Хлоротоксин, специфичный для СТканалов, состоит из аминокислотных остатков, но имеет четыре дисульфидных мостика ,. Са2канала, впервые наблюдались Валдивиа и др. К настоящему времени первичная структура определена для нескольких групп токсинов скорпионов короткого типа и для довольно большой группы нейротоксинов длинного типа. Если предположить, что каждый вид скорпиона имеет приблизительно белков, то общее количество белков, присутствующих в известных видах скорпионов, должно быть около 0 0. В настоящее время определена первичная структура только для 1 общего количества белков, выделенных из яда скорпиона функция некоторых из них еще неизвестна. В Таблице 1 показаны полные аминокислотные последовательности выделенных токсинов. Недавно, многие Иа токсины были получены методом клонирования ДНК ,0. Большинство этих новых белков не включено в Таблицу 1, потому что С концы полученных белков не определены. Кроме того, имеются На токсины, для которых известна только аминокислотная последовательность Ыконца, и эти белки были получены в чистом виде, но данные о последовательности еще не известны ,,. Из Таблицы 1, видно, что Ыатоксины состоят из аминокислотных остатков, имеют восемь фрагментов цистсина в молекуле, и образуют четыре дисульфидных мостика. Очень короткие пептиды от до аминокислотных остатков. Они действуют на апаминочувствительные К каналы. Короткие пептиды от до аминокислотных остатков. Таблица. Сокращения соответствуют названиям скорпионов АаН. Атт, i i , i , . ЛаНГ IVVVX. VVI. АаН1 1V. ИТ 1 VVIV. II. ЛаЖТЗ 4VXXVV0I. АаНГГ4 VVI. V . II. ВаГТ2 V. ВсМЮ VIXI. I VIV1. IVI. XI . I VIVI. XI. XiIVI. XiIV. X
II I IVI. VVI. I2 VVV
VI. VII. СпЗ кЕОУ1ЛК8ТССКУОС1. ШЖЕССтЕСКЛКЖ,ОСУОСЛГССУСЕС1РЕ8ТРТУР1. Си К1ОУ1ЛМКЗТССКУХСи1. ЕНККСОМ1СКЛККдС. Ю8УУСУК. СЧЕуЗ 1слт. СЕ1 К0ОУГУЕКТССККТСУКЬ0ЕСНЯЕСКУКН1Х8УаУСУОРОСУСЕО1. РО8Т0ТУР1. СаЕУ ККХУРУаЖКУЕС1КУСМЦ1. СЕМ1 КЕОУЬУНУТОСКУЕС1КЕаГМОУС1. СИ кЕОУЬУ8К8ТССЖУЕСЬКШОМОУСЕКЕСК0ОУСК. Ч8ООУСУЛГЛСгСТНЬУЕОЛУУР1. С1 V КЕаУЬУКЗУТОСКРЕСРООЮУСЬЯВСЯООУСКОЗССУСУЛРСКСТНЬУЕО. С1 VX. Ь УЯ1ХУ1лдРЕМСУУНСГР8ССОТЬСКЕКСОГ8СНСОТКУСНС1ЛССМ. Ц1Т2 ХУ1КР1ХЗСКУаСШЬТОСОКСКАУОС5УОУСШСЬЛСУСЕ. Ш УЯОЛУ1ЛКттСУУЕСРЯУСН. УКОАУАООСУУТСО8К8УСКГЕСТКНСЛЕУССМ1. ОКУШАСУС1К1. РОКУР1К1РСК. ЗУК1ОУ1ЛдРНМСУУНС1РСОТГСКО,ОАГОСГаСУСиП1. Р Кииохт К1ГХЗУРУПУУКСКК1СЧУКУСН. СК. АПУСит. Г1. ТЫ ШУ1ЛтнЕССКСР1КР8СУСЕСК1ККУСАТЛСУСУ. ТЬ2 ГОУЛтНЕаСК8РСРРКРАСРС1ХУСКТН1. ШУЬМ0НЕССК1СтРУССЯЕС0ЖК8СУСАУРАСУСУ0ГРНУУКУУ0ЯАТЖС . ТУ5 КК1ХУРЕУОРСАУ1СУНУчАУС1Жи. ТОУГХУ ЖЕвУ 1ЛК0СК1ТСТ1. ТТХУ ККООУРУЕООМСАРАСЕОУОКАУСОК1ХЖОККАХУС,УРОСУСУОиН1ЦСЕРТ1СТ1. ТЯ1 0КЕСУ1ЖШНЕСС1а8СР1РР5СУССЯЕСТЬККО0УСАУРАСУСУОЬРиУУК. Те рхулмонеоск8РСРжрлсрсосусктн1кл0усау1лсусуотонк,оулткс . ТбКл. Токсины скорпионов имеют ограниченную гомологию первичных структур. При попарном сравнении токсинов, выделенных из одного и того же вида скорпионов, гомология первичных структур значительно выше, чем при попарном сравнении токсинов, выделенных из разных видов скорпионов. Помимо остатков цистеина, которые принято считать инвариантными или консервативными, в первичных структурах токсинов скорпионов инвариантны по их составу лишь некоторые участки Табл.